Summary
Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.
Abstract
Organoidler, kendi kendini organize eden özellikleri ve birincil doku veya kök hücrelerden yayıldıktan sonra fonksiyon ve mimarinin korunması nedeniyle organ dokusunu modellemek için güvenilir bir yöntemdir. Bu organoid üretim yöntemi, çoklu pasajlar yoluyla tek hücreli farklılaşmadan vazgeçer ve bunun yerine meme epitel organoidlerini mekanik ve enzimatik olarak ayrışmış dokulardan izole etmek için diferansiyel santrifüjleme kullanır. Bu protokol, kollajen ve bodrum hücre dışı matrikse organoid gömme tekniklerine ek olarak, hem fare hem de insan meme dokusundan küçük ve büyük epitelyal organoidleri hızlı bir şekilde üretmek için aerodinamik bir teknik sağlar. Ayrıca, organoid morfolojisini ve yoğunluğunu görselleştirmek amacıyla jel içi fiksasyon ve immünofloresan boyama için talimatlar verilmiştir. Bu metodolojiler, bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürleme ve kollajen invazyonu testi yoluyla ex vivo metastaz modellemesi gibi sayısız aşağı akış analizi için uygundur. Bu analizler, hücre-hücre davranışını daha iyi aydınlatmaya ve tümör mikro ortamındaki etkileşimlerin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlamaya hizmet eder.
Introduction
Epitel hücrelerini in vitro olarak modelleme yeteneği, modern biyomedikal araştırmaların temeli olmuştur, çünkü in vivo olarak erişilemeyen hücresel özellikleri yakalar. Örneğin, iki boyutlu bir düzlemde büyüyen epitel hücre çizgileri, proliferasyon1 sırasında bir epitel hücresinde meydana gelen moleküler değişikliklerin bir değerlendirmesini sağlayabilir. Ayrıca, sinyalizasyon ve gen ekspresyonu arasındaki dinamik düzenlemenin ölçülmesi in vivo sistemlerdesınırlıdır 2. Kanser araştırmalarında, kanser epitel hücre hattı modellemesi, hastalığın ilerlemesinin moleküler sürücülerinin ve potansiyel ilaç hedeflerinin tanımlanmasını sağlamıştır3. Bununla birlikte, iki boyutlu bir düzlemde büyüyen kanser epitel hücre hatlarının sınırlamaları vardır, çünkü çoğu genetik olarak ölümsüzleştirilir ve modifiye edilir, genellikle doğada klonaldir, fizyolojik olmayan koşullarda büyüme yetenekleri için seçilir, üç boyutlu (3B) tümör doku mimarisinin değerlendirilmesinde sınırlıdır ve gerçekçi bir doku ortamında mikro çevre etkileşimlerini yeterincemodellememektedir4. Bu kısıtlamalar, in vivo olarak uzak organ bölgesinde invazyon, yayılma, dolaşım ve kolonizasyon dahil olmak üzere birkaç farklı biyolojik aşamayı içeren metastazın modellenmesinde özellikle belirgindir.5.
Kanser epitel organoidleri, tümörlerin 3D ortamını ve davranışlarını daha iyi özetlemek için geliştirilmiştir 6,7,8. Organoidler ilk olarak tek LRG5 + bağırsak kript hücrelerinden geliştirildi ve ince bağırsağın in vitro9'un hiyerarşik yapısını koruyan kript-villus birimlerinin 3D yapısını temsil edecek şekilde farklılaştırıldı. Bu yaklaşım, homeostatik ve stres koşulları altında kendi kendini organize eden doku mimarisinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine ve karakterizasyonuna izin verdi. Doğal bir uzantı olarak, kolorektal10, pankreas 11, meme 12, karaciğer 13, akciğer14, beyin15 ve mide kanserleri 16 dahil olmak üzere birçok farklı kanser türünü modellemek için kanser epitel organoidleri geliştirilmiştir. Kanser epitelyal organoidleri, kanser evrimi 17,18 ve metastatik mekansal zamansal davranışları 19,20 karakterize etmek ve tümör heterojenliğini sorgulamak 21 ve kemoterapileri test etmekiçin kullanılmıştır 22. Kanser epitel organoidleri de antikanser ajanlarına ve radyasyon tedavisine ex vivo 8,23,24,25 hasta yanıtını tahmin etmek için devam eden klinik çalışmalar sırasında izole edilmiş ve toplanmıştır. Ayrıca, kanser epitel organoidlerini içeren sistemler, etkileşimleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek, kanser epitel hücrelerinin doğal öldürücü hücreler gibi sitotoksik efektör bağışıklık hücrelerinin temel doğasını nasıl değiştirdiğini ortaya çıkarmak ve potansiyel immünoterapileri ve antikor-ilaca bağımlı sitotoksik aktiviteyi test etmek için tümör mikro ortamının daha kapsamlı bir modelini oluşturmak için bağışıklık hücreleri gibi diğer kanser dışı hücrelerle birleştirilebilir26, 27,28. Bu makalede, kollajen ve bodrum hücre dışı matrikse (ECM) pasaj yapmadan ve gömülmeden epitel organoidleri üretme yöntemi gösterilmektedir. Ek olarak, izole organoidlerin aşağı akış görüntüleme teknikleri de paylaşılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makalede kullanılan tüm fare dokuları, Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönetmeliklerine ve kılavuzlarına uygun olarak etik olarak toplanmıştır. Benzer şekilde, tüm hastalar doku bağışından önce bir Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) gözetiminde onay verdiler ve örnekler tanımlanmadı.
NOT: Bu protokol, birincil dokudan organoidlerin oluşumunu açıklar.
1. Malzemelerin gece boyunca hazırlanması
- Bodrum hücre dışı matrise (BECM) gömmek için, BECM aliquot'u 4 ° C'de bırakarak çözün.
2. Kollajenaz ve sığır serum albümini (BSA) kaplama solüsyonunun hazırlanması
- %2,64 BSA/PBS kaplama çözeltisi (BSA Çözeltisi) hazırlayın: 50 mL/0,2 μm filtre şişesi kullanarak steril filtre 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve 4,10 mL'lik %30 BSA çözeltisi. Bu BSA çözeltisi filtrelenebilir ve tekrar kullanılabilir.
- Fare meme dokusu için kollajenaz çözeltisi hazırlayın: Steril filtre 27 mL bazal hücre ortamı, 1.5 mL fetal sığır serumu (FBS), 30 μL 50 mg / mL gentamisin, 15 μL 10 mg / mL insülin, 600 μL 0.1 g / mL kollajenaz A ve 50 mL / 0.2 μm filtre şişesi kullanılarak 600 μL 0.1 g / mL tripsin. Doku kütlesine bağlı olarak fare başına 10 mL ila 30 mL arasında kollajenaz çözeltisi ayırın.
- İnsan meme dokusu için kollajenaz çözeltisi hazırlayın: Steril filtre 18 mL RPMI-1640, 200 μL 100x penisilin-streptomisin çözeltisi (kalem / strep), 200 μL 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) Tampon, 1 mL FBS ve 400 μL 0.1 g / mL Kollajenaz A, 50 mL / 0.2 μm filtre şişesi kullanarak. Doku kütlesine bağlı olarak doku örneği başına 10 mL ile 20 mL arasında tahsis edin.
3. Medya hazırlama
- Organoid ortam hazırlayın: 50 mL/0,2 μm filtre şişesi kullanılarak %1 kalem/strep ve %1 İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS) içeren steril filtre bazal hücre ortamı. Organoid büyüme faktörü medyası yapmak için, 2.5 nM'lik bir son konsantrasyona bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyin.
- Meme epitel ortamı hazırlamak: 100 mL meme epitel ortamı yapmak için, 1 mL 100x glutamin takviyesi ile steril filtre yüksek glukozlu ortak bazal ortam, 1 mL kalem / strep, 1 mL 10 mM HEPES tamponu (7.3 pH), 250 μL% 30 BSA stoğu, 1 μL 1 mg / mL kolera toksin stoğu, PBS'de 1 mL 50 μg / mL hidrokortizon stoğu, 50 μL 10 mg/mL insan insülin çözeltisi, 10 μL 50 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) stoğu ve 150 mL/0,2 μm filtre şişesi kullanılarak %1 FBS. Ortamı 4 ° C'de saklayın ve 2 haftaya kadar kullanın.
- Amfoterisin yıkama hazırlayın: %2 kalem/strep ve %2 amfoterisin B. ile steril filtre PBS, 4 °C'de saklayın.
4. Doku toplanması ve sindirilmesi
- Fare meme dokusu
- Fareyi 2-5 dakika boyunca bir CO2 odasına yerleştirerek ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık ile takip edin. Ventral taraf yukarı bakacak şekilde, fare uzuvlarını oynatın ve fareyi pençelerinden emici bir pedle kaplı bir tahtaya sabitlemek için dört adet 19 G iğne kullanın. Kürkü yumuşatmak ve cildi sterilize etmek için% 70 etanol püskürtün. Dışkıyı bir gazlı bez pedi veya mendille silin.
- Anogenital bölgenin hemen üstünden başlayarak, cerrahi makas kullanarak orta hattan yukarı doğru kesin, periton boyunca delinmemeye özen gösterin. Çeneye ulaştıktan sonra, hem klavikulaları hem de arka bacakları aşağı doğru yanal kesikler yapın ve meme yağ pedlerini ortaya çıkarmak için farenin derisini tahtaya sabitleyin.
- Arka bacakların yakınında bulunan inguinal lenf nodunu tanımlayarak vahşi tip farelerde kasık meme yağ pedlerini bulun. Torasik meme yağ yastıklarını vahşi tip farelerde ön ekstremitelerin altındaki daha kalın, vaskülarize doku olarak bulun.
- Meme yağ yastığını yükseltmek için forseps kullanın. Altta yatan kası toplamaktan kaçının. Keskin-künt makasların künt ucunu kullanarak, meme yağ yastığının altında, deriden uzakta bir cep oluşturun. Meme yağ yastığını tek parça halinde kesin.
- Meme yağ yastıkları çıkarıldıktan sonra, steril bir doku kültürü kabına koymadan önce PBS'de durulayın. Hızlı bir şekilde bir doku kültürü başlığına aktarın.
NOT: Meme tümörleri için, tümörü deriden nazikçe uzaklaştırmak için PBS ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Koyu renk değişikliği nekrozu gösterdiğinden koyulaşmış veya yumuşak alanlardan kaçındığınızdan emin olun, bu da sağlıklı organoidler vermeyecektir. - Meme tümörlerini #10 veya #11 neşter ile kıyarak macun benzeri bir kıvama ulaşana kadar dokuyu gevşetin. Kıyılmış dokuyu bir neşter kullanarak 10-30 mL kollajenaz çözeltisi içeren konik bir tüpe aktarın. Tüm dokuların toplandığından emin olmak için, doku kültürü plakasına ve konik tüpe geri 1 mL kollajenaz çözeltisi pipetin.
NOT: Daha büyük organoidler üretmek için, mekanik sindirim en aza indirilmeli ve bazı küçük görünür doku parçaları bozulmadan bırakılmalıdır. Alternatif olarak, doku daha sonraki organoid preparatlar için dondurulmuş olarak saklanabilir ve canlılıkta minimum kayıp olabilir. Bunu yapmak için, dokuyu bir PBS veya bazal hücre ortamı +% 1 FBS çözeltisinde yıkayın ve daha sonra yüzey alanını artırmak için kabaca kıyın (dokuyu bir veya iki katı parçada tutarak). Dokuyu dondurucu ortam içeren bir kriyo-şişeye taşıyın (% 90 FBS +% 10 dimetil sülfoksit (DMSO)). Sıvı azot deposuna geçmeden önce şişeleri gece boyunca kontrollü bir dondurma kabında dondurun. - Konik tüpü, doku gerginleşene ve kollajenaz çözeltisi bulanıklaşana kadar 180 RPM'de 37 °C'lik bir tezgah üstü sallama inkübatörüne yerleştirin. Örneğin, bir tümörden büyük bir doku kütlesi (yaklaşık 500-800 mg) 30-60 dakika sürer. Vahşi tip meme yağ yastıklarından daha küçük bir doku kütlesi (yaklaşık 100-300 mg) yaklaşık 20-30 dakika sürer. Emin değilseniz, 5 dakikalık aralıklarla kontrol edin.
- Kuluçkadan sonra, konik tüpü oda sıcaklığında (RT) 550 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı konik tüpten dikkatlice aspire edin.
NOT: İleriye dönük olarak, plastiğe yapışma nedeniyle organoid kaybını önlemek için tüm pipet uçlarını, serolojik pipetleri ve konik tüpleri BSA çözeltisi ile önceden kaplayın. - Tüpe 8 mL bazal hücre ortamı ve 80 μL DNaz çözeltisi [2 U / μL] ekleyin. 1-3 dakika boyunca yavaşça ters çevirin.
- Tüpe 12 mL bazal hücre ortamı ekleyin ve pipetle çekerek dikkatlice karıştırın veya karıştırmak için tüpü 15 kez yavaşça döndürün.
- RT'de 550 x g'de 10 dakika santrifüj .
- Süpernatanı aspire edin ve daha sonra peleti 12 mL bazal hücre ortamında yeniden askıya alın.
- En ağır doku parçalarının dibe çökmesine izin verin. Süpernatantı serolojik bir pipet ile toplayın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Bu süspansiyon epitel organoidleri ve stromal / immün hücreleri içerir.
- İnsan meme dokusu
- İnsan meme dokusu örneklerini organoidler için işleyin veya toplandıktan sonraki 24 saat içinde saklayın. Numuneleri CO2-Bağımsız ortamda %1 100x antibiyotik-antimikotik ile 4 °C'de saklayın.
- Dokuyu bir doku kültürü plakasına aktarın. Plakayı eğin ve fazla depolama ortamını aspire edin ve ardından dokuyu 5 mL amfoterisin B yıkama ile durulayın. Amfoterisin B yıkamasını derhal çıkarın.
- Doku örneğini #10 veya #11 neşterle kıyarak dokuyu macun benzeri bir kıvama ulaşana kadar gevşetin. Kıyılmış dokuyu bir neşter kullanarak 10-30 mL kollajenaz çözeltisi içeren konik bir tüpe aktarın. Tüm dokunun toplandığından emin olmak için, doku kültürü plakasına 1 mL kollajenaz çözeltisi pipetin ve konik tüpe geri dönün.
NOT: Daha büyük organoidler üretmek için, mekanik sindirim en aza indirilmeli ve bazı küçük görünür doku parçaları bozulmadan bırakılmalıdır. Bu protokol için başlangıç dokusu kütlesi 100-250 mg arasında değişmekteydi. Alternatif olarak, doku daha sonraki organoid preparat için dondurulmuş olarak saklanabilir ve yukarıdaki gibi% 90 FBS +% 10 DMSO'da 4.2.2 adımından sonra canlılıkta minimum kayıp yaşanabilir. - Konik tüpü, doku küçülene ve kollajenaz bulanıklaşana kadar 180 RPM'de 37 ° C'lik bir tezgah üstü sallama inkübatörüne yerleştirin. Dokuyu 5 dakikalık aralıklarla kontrol edin. İnsan örneklerinin kollajenaz ayrışması yaklaşık 5-20 dakika sürer.
- Kuluçkadan sonra, konik tüpü RT'de 550 x g'de 10 dakika boyunca döndürün.
- Süpernatantı konik tüpten dikkatlice aspire edin.
NOT: İleriye dönük olarak, plastiğe yapışma nedeniyle organoid kaybını önlemek için tüm pipet uçlarını, serolojik pipetleri ve konik tüpleri BSA çözeltisi ile önceden kaplayın. - Konik tüpe 4 mL bazal hücre ortamı ve 40 μL DNaz çözeltisi [2 U / μL] ekleyin. 3 dakika boyunca yavaşça ters çevirin.
- Tüpe 6 mL bazal hücre ortamı ekleyin ve pipetle dikkatlice karıştırın veya konik tüpü karıştırmak için 15 kez yavaşça döndürün.
- RT'de 550 x g'de 10 dakika santrifüj .
- Süpernatanı aspire edin ve daha sonra peleti 10 mL bazal hücre ortamında yeniden askıya alın.
- En ağır doku parçalarının dibe çökmesine izin verin. Süpernatantı toplayın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Bu süspansiyon epitel organoidleri ve stromal / immün hücreleri içerir.
5. Diferansiyel santrifüjleme
- RT'de 3-4 s için 550 x g'ye kadar nabız atın, süpernatanı aspire edin ve peleti 10 mL bazal hücre ortamında yeniden askıya alın. Bu adımı üç kez daha tekrarlayın (toplam dört spin).
- Her santrifüjlemeden sonra, peletin giderek daha opak hale geldiğinden emin olun. Bu kalan pelet epitelyal organoidler olacaktır.
6. Küçük organoidlerin toplanması
- RT'de 3 s için 80-100 x g'ye kadar nabız atın. Süpernatantı taze BSA kaplı bir tüp halinde toplayın ve ardından küçük organoidleri peletlemek için RT'de 3 s için 550 x g'ye darbe.
7. Organoidlerin BECM'ye gömülmesi
- Aliquot organoidlerin mikrosantrifüj tüplerine uygun süspansiyonu, kuyu başına BECM miktarına göre organoid yoğunluğuna göre (Tablo 1). Örneğin, 96 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda 20 μL BECM için 50-100 organoid kullanın.
NOT: Organoid yoğunluğu aşağıdaki formül kullanılarak sayılabilir: ((Ortalama organoid sayısı)/50 μL) x seyreltme faktörü. - Tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. Çözülmüş BECM'yi bir doku kültürü başlığı içinde buz üzerine yerleştirin. Kaputu hazırlarken, soğuması için tüm pipet uçlarını buzun üzerine yerleştirin.
- Mikrosantrifüj tüplerini RT'de 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpleri organoid peletlerle buza doğru hareket ettirin ve her bir mikrosantrifüj tüpüne uygun miktarda BECM ekleyin (Tablo 1).
NOT: BECM viskoz olduğundan, pipet ucundaki kaybı hesaba katmak için ek hacimler (kubbe hacminin yaklaşık %10-%20'si ekstra) ekleyin. - BECM'deki organoidleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, kabarcık üretmemeye dikkat edin.
- BECM süspansiyonlu organoidleri yavaşça ve dikkatli bir şekilde kaplama yüzeyine pipetleyin. Pipetleme sırasında, bir kubbe oluşturmak için pipeti yavaşça yukarı kaldırın. Nemi korumak için tüm boş kuyucukları PBS ile doldurun.
- BECM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı 1 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve ardından uygun ortam hacmiyle örtün (Tablo 1).
8. Organoidlerin kollajene gömülmesi
- Tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. Kollajen çözeltisini, sıralı sırayla, 375 μL 10x DMEM, 100 μL 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ve 3 mL sıçan kuyruğu kollajen I çözeltisini 15 mL konik bir tüpte birleştirerek hazırlayın. Pipet karışımı, kabarcık yapmamaya özen göstererek. Çözeltiyi, gerektiğinde küçük miktarlarda (1-3 μL'lik artışlar) NaOH veya 10x DMEM ile 7.2-7.4'lük bir pH'a titre edin.
- Kuyuların dibini, kuyunun tabanını tamamen örtmek için gereken minimum kolajen miktarıyla kaplayın. Bir yaklaşım, az miktarda kollajen yerleştirmek ve plakayı bir yandan diğer tarafa ve kaplamaya sallamaktır. Kollajen altlıklarının 30 dakika-2 saat boyunca 37 °C'ye ayarlanmasına izin verin.
- Aliquot organoidlerin mikrosantrifüj tüplerine uygun süspansiyonu, kuyu başına kollajen miktarına göre organoid yoğunluğuna göre (Tablo 1). 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Kollajen çözeltisini 4 ° C'de saklayın ve her 10 dakikada bir mikroskop altında lif oluşumunu kontrol ederek polimerizasyonu izleyin. Kollajen 30 dakika-2 saat arasında uygun polimerizasyona ulaşacaktır.
NOT: Uygun polimerizasyon, matris boyunca dallanan liflerin varlığı ile belirlenebilir. Görüş alanında birkaç lif gözlendikten hemen sonra adım 8.5'e geçin. - RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'de mikrosantrifüj tüplerini santrifüj edin. Organoid peletleri buza taşıyın ve her bir mikrosantrifüj tüpüne uygun miktarda kollajen ekleyin (Tablo 1).
NOT: Kollajen viskoz olduğundan, pipet ucundaki kaybı hesaba katmak için ek hacimler (kubbe hacminin yaklaşık% 10 -% 20'si ekstra) kollajen ekleyin. - Kollajendeki organoidleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, kabarcık üretmemeye dikkat edin.
- Kollajen süspansiyonlu organoidleri yavaşça ve dikkatlice kaplama yüzeyine pipetleyin. Pipetleme sırasında, bir kubbe oluşturmak için pipeti yavaşça yukarı kaldırın. Nemi korumak için tüm boş kuyucukları PBS ile doldurun.
- Kollajenin katılaşmasını sağlamak için plakayı 1 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve ardından uygun ortam hacmiyle örtün (Tablo 1).
- NOT: Organoidler 3D matriste 7 güne kadar canlılığını korur. Analiz için görüntüleme kullanılıyorsa, adım 9 ve 10'a geçin.
9. Gömülü organoidlerin sabitlenmesi
- ECM kubbeleriyle temas etmeden kuyucuklardaki tüm ortamları çıkarmak için pipet kullanın.
- 5 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA)/PBS çözeltisi ile sabitleyin.
- PBS'yi yavaşça hareket eden bir çalkalayıcıya yerleştirdikten sonra kuyucuklara uygulayarak iki ila üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, kubbelere taze PBS uygulayın ve plakayı 4 ° C'de saklayın.
10. Gömülü organoidlerin immünofloresan boyanması
- İmmünofloresan boyama için çözeltilerin hazırlanması
- Geçirgenlik tamponu: %10 Triton X-100 içeren bir PBS çözeltisi hazırlayın.
- Engelleme arabelleği: %10 FBS ve %0,2 Triton X-100 içeren bir PBS çözeltisi hazırlayın.
- Antikor seyreltme tamponu:% 2 FBS ve% 0.2 Triton X-100 ile bir PBS çözeltisi hazırlayın.
- Geçirgenlik ve blokaj
- Pipet, ECM kubbelerini örtmek için yeterli geçirgenlik tamponu. RT'de yavaş hareket eden bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca inkübe edin.
- Geçirgenlik tamponunu bir pipetle çıkarın ve 3 saat boyunca aynı hacimdeki blokaj tamponunu uygulayın.
- Birincil antikor inkübasyonu
- Bloke edici tamponu bir pipetle çıkarın ve birincil antikoru içeren antikor seyreltme tamponunu üretici tarafından belirlenen konsantrasyonlarda uygulayın. Numuneyi yavaş hareket eden bir çalkalayıcıda 12-16 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve numuneleri yavaş hareket eden bir çalkalayıcıda RT'de PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- İkincil antikor inkübasyonu ve nükleer leke
- Kalan PBS yıkamasını aspire edin ve ikincil antikor içeren antikor seyreltme tamponunu üretici tarafından belirlenen konsantrasyonlarda uygulayın. Ek olarak, tampona DAPI veya Hoechst (çekirdekleri etiketlemek için) veya falloidin (aktini etiketlemek için) 1:250 oranında ekleyin. RT'de yavaş hareket eden bir çalkalayıcıda 2-4 saat boyunca kuluçkaya yatın.
- İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve numuneleri bir çalkalayıcıda RT'de PBS'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Örnekleri görüntülemeye kadar PBS'de 4 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de yer alan görüntüler, insan ve fare dokularından vahşi tip ve tümörlü meme epitel organoidlerine bir örnek sunmaktadır. Epitel organoidlerini diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole etme yönteminin bir bakışta bir örneği, Şekil 1A'daki karikatür iş akışında, farklı türlerden birincil dokuların parlak alan görüntülerinde gösterildiği gibi epitel dokusu verirken neredeyse aynı şekillerde işlenebileceğini göstermektedir (Şekil 1B ). Ayrıca, bu türler arası doku kompozisyonu benzerlikleri, Şekil 2A-D'de görüntülenen bodrum hücre dışı matriks veya kollajendeki gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülerinde görülebilir. Organoid yapı, membran Domates (mDomates) etiketleme veya aktinin faloidin boyanması yoluyla görselleştirilebilir. Bu rakamlar aynı zamanda bu yöntemi kullanarak beklenen organoid bileşimi ve boyutunu da göstermektedir. Kollajen matrisine gömülü organoidler bir istila testi için kullanılabilir ve Şekil 2C'de görüldüğü gibi organoidin kendisinden dallanan dalların genişlemesini izleyerek analiz edilebilir. Son olarak, parafin gömülü organoidlerin hematoksilin ve eozin (H & E) boyaması, organoidlerin meme kanserinin aynı histolojisini koruduğunu göstermektedir (Şekil 2E).
Şekil 1: Örnek organoidlerle epitel organoid üretimi için iş akışı. (A) Fare veya insan dokusundan pasajsız organoid üretimi için iş akışı şeması. (B) İzolasyonu takiben fare WT meme bezlerinden, fare meme tümörlerinden ve insan meme tümörlerinden izole epitel organoidlerinin temsili görüntüleri. Her görüntü, gelişmiş görselleştirme için parlaklık ve kontrast için ayrı ayrı ayarlandı. Görüntüler, 10x büyütmede ters çevrilmiş bir epi-floresan mikroskopta parlak alanda çekildi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Meme tümörleri MMTV-PyMT farelerden izole edildi; normal meme dokusu FVB farelerden izole edildi. Fareler29 yaşları 8-14 arasında değişiyordu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre dışı matriksteki organoidlerin görüntülenmesi. Her görüntü, bu koleksiyon için gelişmiş görselleştirme amacıyla parlaklık ve kontrast için ayrı ayrı ayarlandı. Görüntülemeden önce örnekler %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Vahşi tip örnekler, hücre zarını görselleştirmek için falloidin 568 ile boyandı ve tüm örnekler, organoid morfolojisi ve yoğunluğu gösteren çekirdekleri görselleştirmek için Hoechst ile boyandı. Görüntüler konfokal mikroskopta 10x büyütmede çekildi ve 3.003'lük bir tarama yakınlaştırmasıyla daha da büyütüldü. DAPI'yi tespit etmek için kullanılan lazer dalga boyu 5 gücünde 405 nm idi ve falloidini tespit etmek için kullanılan lazer dalga boyu 0.5 gücünde kanal 3 için 561.0 nm idi. Konfokal iğne deliği boyutu tüm görüntüler için 19.16'da tutuldu. (A) 0. Günde BECM'ye gömülü fare meme WT organoidinin temsili parlak alan görüntüsü. (A') 1:250 Hoechst etiketleme çekirdeği ve (A'') 1:250 falloidin etiketleme aktin-immünofloresan görüntüleri A. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Normal meme dokusu FVB farelerden izole edildi. Fareler 8-12 haftalıkken değişiyordu. (B) 0. Günde BECM'ye gömülü fare meme tümörü organoidinin temsili parlak alan görüntüsü. (B') 1:250 Hoechst etiketleme çekirdekleri ve (B'') Domates etiketli immünofloresan görüntüsünün B. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Meme tümörleri MMTV-PyMT farelerden izole edildi. Fareler 12-14 haftalıkken değişiyordu. (C) 3. Günde Kollajen I'e gömülü fare meme tümörü organoidinin temsili parlak alan görüntüsü. Görüntü, "istilacı" özelliği gösteren bir organoidi temsil ediyor. (C') 1:250 Hoechst etiketleme çekirdekleri ve (C') C. Ölçek çubuğunun domates etiketli immünofloresan görüntüsü 20 μm'yi temsil eder. Meme tümörleri MMTV-PyMT farelerden izole edildi. Fareler 12-14 haftalıkken değişiyordu. (D) 0. Günde BECM'ye gömülü insan meme tümörü organoidinin temsili parlak alan görüntüsü. (D') Hoechst etiketleme çekirdekleri ve (D'') 1:250 Aktin hedeflemeli falloidin etiketli immünofloresan görüntü D. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. (E) BECM'ye gömülü ve 20x büyütmede çekilen H&E ile boyanmış bir organoidin kesitli görüntüsü. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. H&E boyaması, Teksas Üniversitesi Güneybatı Doku Yönetimi Paylaşılan Kaynak30 tarafından gerçekleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kültür plakası | ECM kubbe hacmi | Önerilen organoid sayısı | Medya ses düzeyi |
| 6 delikli plaka | 200 μL | 300 | 3 mL |
| 12 delikli plaka | 150 μL | 225 | 2 mL |
| 24 delikli plaka | 100 μL | 150 | 1 mL |
| 48 delikli plaka | 40 μL | 60 | 300 μL |
| 96 delikli plaka | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tablo 1: Kubbeler için önerilen ECM bileşenleri hacmi, organoidlerin yoğunluğu ve değişen kültür plakalarında kuyu başına ihtiyaç duyulan ortam hacmi.
| Sorun | Potansiyel neden | Çözüm | |||
| ECM kubbeleri çöktü. | Plaka sallandı, ECM hacmi kubbe şeklinin sürdürülemeyeceği kadar büyüktü ya da kubbeler kuyunun kenarına dokunuyor, yapışıp düşmelerine neden oluyordu. | Kubbeler ayarlanmadan önce plakayı çok kuvvetli bir şekilde hareket ettirmekten kaçının, organoidlerin yeniden süspansiyonu için kullanılan ECM hacmini azaltın veya plakanın ortasındaki kubbeleri pipetlemek için çok dikkatli olun. | |||
| Organoidlere benzemeyen dokular var. | Kas dokusu veya sinir, meme yağ yastığının toplanması sürecinde toplanmış olabilir. | Sadece açıkça bir meme yağ yastığı olanı kesin. Cilde sıkıca yapışan dokuyu çıkarmaktan kaçının. | |||
| Birçok ölü organoid var. | Nekrotik tümör dokusu toplandı. | Dokuyu nekrotik, kistik, aşırı yumuşak veya daha koyu renkli tümörlerden toplamaktan kaçının. Tümör dokusu sağlam olmalıdır. | |||
| Organoidlerden daha fazla tek hücre vardır. | Doku çok ince kıyıldı veya kollajenaz sindirimi çok uzun süre çalıştırıldı. | Dokuyu aşırı kıymaktan kaçının veya kollajenaz kuluçka süresini azaltın. | |||
| ECM'de kabarcıklar var. | Pipetleme ile yeniden süspansiyon çok güçlüydü ve kubbeleri pipetleme yaparken fırlatma çok hızlıydı. | ECM'deki organoidleri yavaşça yeniden askıya alın ve yavaşça kubbelere pipetleyin. Sorun devam ederse, pipetleme sırasında ikinci durağa gitmekten kaçının. | |||
| Kollajen içinde organoidlerin istilası yoktur. | Kollajen uygun şekilde polimerize edilmedi veya aşırı polimerize edilmedi. | Organoidi kollajen içinde uygun şekilde polimerize olana kadar tekrar askıya almayın. Her 30 dakikada bir kontrol edin. Polimerizasyon görünmüyorsa, 2 saat işaretinde ve plakada derhal yeniden askıya alın. | |||
| Polimerizasyonu izlerken görünür kollajen lifleri yoktur. | Mikroskop ayarları uygun değildi. | Maksimum karanlık için faz kontrastını ayarlayın, ardından mikroskopun parlaklığını tamamen yukarı getirin. Ek olarak, büyütmeyi artırmak görüntülemeyi geliştirebilir. | |||
| ECM kubbeleri çözüldü. | Fiksasyon süresi çok uzundu veya PFA, ECM'ye gömülü numunelerden tamamen çıkarılmadı. | ECM kubbelerinin sabitlenme süresini 5 dakikanın altında tutun ve her biri 5 dakika boyunca dönen bir çalkalayıcı üzerinde beş yıkama ile takip edin. | |||
Tablo 2: Olası sorunlar, nedenler ve çözümler tablosu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Literatürde tümör organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlanmıştır. Bu protokol, tümör organoidlerini doğrudan tümörden pasaj olmadan üretmek için bir yöntemi vurgulamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, tümör organoidleri prosedürün başlatılmasından sonraki saatler içinde üretilebilir ve literatürde bildirilen %70'e kıyasla %100'e yakın canlı organoidler üretir31. Buna karşılık, diğer yöntemler hücrelerin birkaç hafta boyunca organoidlere seri geçişini gerektirir. Böylece, uzun süreli kültürün etkisi olmadan aynı konakçıdan eşleşen organoid ve bağışıklık örnekleriyle bağışıklık hücresi etkileşimlerinin belirlenmesi ve görselleştirilmesi gibi aşağı akış uygulamaları daha uygulanabilir hale gelir. Ayrıca, Şekil 2C'de vurgulandığı gibi, tümör organoidlerinin farklı hücre dışı matrislere gömülmesi, primer tümörden invazyon gibi metastatik kaskad boyunca anahtar fenotiplerin tanımlanmasına izin verebilir. Diğer aşağı akış uygulamaları, çeşitli epitel hücre davranışlarını değerlendirmek için dallanma morfogenezi32, invazyon, yayılma ve koloni oluşumu33'ün fenotipik tahlillerini içerir. İmmün etkileşimler ayrıca bu organoid bazlı tahlillerle işlevsel ve görsel olarak da yakalanabilir. Ayrıca, standart biyokimyasal ve akış bazlı tahliller kullanılarak genetik ve protein içeriğinin aşağı akış analizi için gömülü hücreleri izole etmek için jeller çözülebilir. Son olarak, tümör dokusundan büyük miktarlarda organoid hızlı bir şekilde üretilebildiğinden, bu testler ilaç tarama uygulamaları ve klinik araştırma iş akışlarına entegrasyon için ölçeklendirilebilir.
Bu protokol için kritik olan birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, kollajenaz sindirimi için gereken süre, doku bileşimine ve sindirilen doku miktarına bağlıdır. Örneğin, insan meme tümörü cerrahi örnekleri (ortalama 100-250 mg) gibi daha küçük doku parçalarıyla çalışırken, daha kısa bir sindirim süresi gereklidir. Bununla birlikte, bir fareden toplanan meme tümörleri boyut olarak çok daha büyüktür (500-800 mg) ve 30-60 dakikalık enzimatik sindirim gerektirebilir. İkincisi, epitel organoidlerinin maksimum verimini sağlamak için, plastiğe hücre yapışmasından kaynaklanan kayıpları önlemek için tüm pipet uçlarının ve serolojik pipetlerin BSA ile kaplanması da önemlidir. Üçüncüsü, epitel dışı doku bileşenlerini ortadan kaldırmak için kısa bir diferansiyel santrifüjleme süresi çok önemlidir. Bu yaklaşım, daha ağır epitelyal organoidlerin pelete girmesine izin verirken, daha hafif stromal ve immün kompartmanlar süpernatantta kalır. Organoidleri kollajen içine gömerek istila testleri oluşturmak için, organoidleri gömmeden önce kollajenin uygun polimerizasyonuna izin vermek çok önemlidir. Bu adım, ışık mikroskobu altında kollajen lifi oluşumu doğrulanarak görsel olarak kontrol edilmelidir. Son olarak, en iyi görüntüleme sonuçları için, ECM'deki organoidleri ve kaplamayı yeniden askıya alırken kabarcıklar üretmekten kaçınmaya özen gösterin. Kabarcıklar jel içindeki organoidleri gizleyecek ve görüntüleri bozacaktır. Tablo 2 , karşılaşılan olası sorunları ve bu zorlukların üstesinden gelmek için çözümleri listeler.
Protokoldeki belirli adımlar, oluşturulan organoidlerin boyutunu özelleştirmek veya protokolü yürütmek için gereken süreyi azaltmak için değişikliklere izin verir. Örneğin, mekanik sindirim süresinin arttırılması, daha kısa bir kollajenaz sindirim süresine, daha küçük organoidlere ve daha fazla bireysel hücreye neden olabilir. Kollajenaz sindirimini takiben santrifüjleme, büyük miktarda tümör dokusu ile çalışıyorsa 5 dakikaya kadar kısaltılabilir. Organoidlerin kültürlenmesi ve yetiştirilmesi için kullanılan ortamlar, organoid üretim aşamalarında zamandan tasarruf etmek için bir gün önce hazırlanabilir. Benzer şekilde, tümör dokusu organoid preparasyondan önce uygun ortamda 24 saate kadar saklanabilir. Zaman son derece sınırlıysa, bu protokol toplama gününde tümör dokusunu dondurarak adımların duraklatılmasını içerir. Daha sonra, bu dondurulmuş dokular daha sonraki bir tarihte canlı organoidler üretmek için kullanılabilir. Dondurulmuş dokudan türetilen organoidlerin yaklaşık% 90'ı yaşayabilirdi, ışık mikroskobu altında ve tripan mavisi bir çözelti ile görsel olarak doğrulandı.
Bu protokolde bazı sınırlamalar vardır. Bu yaklaşım hızlı bir şekilde canlı organoidler üretirken, üretilen organoidlerin miktarı tümör dokusunun miktarı ile sınırlıdır. Bu sınırlama, tümör dokusu miktarının daha az olduğu veya bazen birkaç hücreyle sınırlı olduğu klinik örneklerle çalışırken özellikle belirginleşir. Başlangıç malzemesi olarak sadece birkaç hücrenin geri kazanılabildiği aşırı durumlarda, pasaj daha iyi bir seçenek olabilir. Diğer bir sınırlama ise bu yöntemin indirgemeci yaklaşımıdır. Fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi stromal kompartmanların çıkarılması epitelyal organoid oluşumunu zenginleştirir. Bununla birlikte, bu hücre popülasyonları tümörün işlevi için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, bunların çıkarılması, yalnızca epitelyal organoid modellerden türetilen tümör biyolojisinin yorumlanmasını sınırlar. Sonuç olarak, bu protokol, aşağı akış görüntüleme, fonksiyonel (immün etkileşimler dahil) ve ilaç tarama uygulamalarında acil kullanım için epitel organoidlerinin hızlı bir şekilde üretilmesi için bir yaklaşım sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation ve NCI / UTSW Simmons Kanser Merkezi P30 CA142543 tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir. Simmons Kapsamlı Kanser Merkezi'nde paylaşılan bir kaynak olan Teksas Üniversitesi Güneybatı Doku Yönetimi Ortak Kaynağı'nın yardımına teşekkür ediyoruz ve kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından P30 CA142543 ödül numarası altında desteklenmektedir. Chan Lab'ın tüm üyelerine özel teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
