Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage
Summary
Denne protokol diskuterer en tilgang til generering af epitelorganoider fra primær normal og tumorbrystvæv gennem differentiel centrifugering. Desuden er instruktioner inkluderet til tredimensionel dyrkning samt immunofluorescerende billeddannelse af indlejrede organoider.
Abstract
Organoider er en pålidelig metode til modellering af organvæv på grund af deres selvorganiserende egenskaber og tilbageholdelse af funktion og arkitektur efter formering fra primært væv eller stamceller. Denne metode til organoidgenerering giver afkald på enkeltcelledifferentiering gennem flere passager og bruger i stedet differentiel centrifugering til at isolere brystepitelorganoider fra mekanisk og enzymatisk dissocieret væv. Denne protokol giver en strømlinet teknik til hurtigt at producere små og store epitelorganoider fra både muse- og humant brystvæv ud over teknikker til organoidindlejring i kollagen og kælder ekstracellulær matrix. Desuden gives instruktioner til in-gel-fiksering og immunofluorescerende farvning med det formål at visualisere organoidmorfologi og densitet. Disse metoder er velegnede til utallige downstream-analyser, såsom co-kultivering med immunceller og ex vivo-metastasemodellering via kollageninvasionsassay. Disse analyser tjener til bedre at belyse celle-celleadfærd og skabe en mere fuldstændig forståelse af interaktioner inden for tumormikromiljøet.
Introduction
Evnen til at modellere epitelceller in vitro har været grundlaget for moderne biomedicinsk forskning, fordi den fanger cellulære funktioner, der ikke er tilgængelige in vivo. For eksempel kan voksende epitelcellelinjer i et todimensionelt plan give en vurdering af de molekylære ændringer, der opstår i en epitelcelle under proliferation1. Desuden er måling af den dynamiske regulering mellem signalering og genekspression begrænset i in vivo-systemer 2. I kræftforskning har kræftepitelcellelinjemodellering muliggjort identifikation af molekylære drivkræfter for sygdomsprogression og potentielle lægemiddelmål3. Imidlertid har voksende kræftepitelcellelinjer på et todimensionelt plan begrænsninger, da de fleste er genetisk udødeliggjort og modificeret, ofte klonale, udvalgt for deres evne til at vokse under ikke-fysiologiske forhold, begrænset i deres vurdering af tredimensionel (3D) tumorvævsarkitektur og ikke tilstrækkeligt modellere mikromiljøinteraktioner inden for et realistisk vævsmiljø4. Disse begrænsninger er især tydelige i modellering af metastaser, som in vivo inkluderer flere forskellige biologiske stadier, herunder invasion, spredning, cirkulation og kolonisering på det fjerne organsted5.
Cancer epitelorganoider er udviklet til bedre at rekapitulere 3D-miljøet og opførsel af tumorer 6,7,8. Organoider blev først udviklet fra enkelte LRG5+ tarmkryptceller og differentieret til at repræsentere 3D-strukturen af krypt-villus-enheder, der opretholdt tyndtarmens hierarkiske struktur in vitro9. Denne tilgang tillod visualisering og karakterisering i realtid af selvorganiserende vævsarkitektur under homeostatiske og stressforhold. Som en naturlig forlængelse blev kræftepitelorganoider udviklet til at modellere mange forskellige kræfttyper, herunder kolorektal 10, bugspytkirtel11, bryst12, lever13, lunge 14, hjerne 15 og gastrisk kræft 16. Kræftepitelorganoider er blevet udnyttet til at karakterisere kræftudvikling17,18 og metastatisk spatiotemporal adfærd 19,20 og forhøre tumorheterogenitet 21 og teste kemoterapier22. Kræftepitelorganoider er også blevet isoleret og indsamlet under igangværende kliniske forsøg for at forudsige patientens respons på kræftmidler og strålebehandling ex vivo 8,23,24,25. Desuden kan systemer, der inkorporerer kræftepitelorganoider, kombineres med andre ikke-kræftceller, såsom immunceller, for at danne en mere omfattende model af tumormikromiljøet for at visualisere interaktioner i realtid, afdække, hvordan kræftepitelceller ændrer den grundlæggende karakter af cytotoksiske effektorimmunceller såsom naturlige dræberceller og teste potentielle immunterapier og antistofafhængig cytotoksisk aktivitet26, 27,28. Denne artikel demonstrerer en metode til generering af epitelorganoider uden passage og indlejring i kollagen og kælder ekstracellulær matrix (ECM). Derudover deles teknikker til nedstrøms billeddannelse af isolerede organoider også.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskellige metoder er blevet beskrevet i litteraturen til at generere tumororganoider. Denne protokol fremhæver en metode til generering af tumororganoider direkte fra tumoren uden at passere. Ved hjælp af denne metode kan tumororganoider produceres inden for få timer efter initiering af proceduren og genererer tæt på 100% levedygtige organoider sammenlignet med 70% rapporteret i litteraturen31. Til sammenligning kræver andre metoder seriel passaging af celler i organoider over flere uger. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af finansiering fra METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation og NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi anerkender hjælpen fra University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delt ressource på Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvist støttes af National Cancer Institute under tildelingsnummer P30 CA142543. Særlig tak til alle medlemmer af Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
Riferimenti
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
