계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징
Summary
이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.
Abstract
오가노이드는 일차 조직 또는 줄기 세포에서 증식한 후 자기 조직화 특성과 기능 및 구조 유지로 인해 장기 조직을 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 오가노이드 생성 방법은 여러 계대를 통한 단일 세포 분화를 포기하고 대신 차등 원심분리를 사용하여 기계적 및 효소적으로 해리된 조직에서 유방 상피 오가노이드를 분리합니다. 이 프로토콜은 콜라겐 및 기저 세포외 기질에 오가노이드를 포매하는 기술 외에도 마우스와 인간 유방 조직 모두에서 크고 작은 상피 오가노이드를 신속하게 생산하기 위한 간소화된 기술을 제공합니다. 또한, 오가노이드 형태 및 밀도를 시각화하기 위해 겔 내 고정 및 면역형광 염색에 대한 지침이 제공됩니다. 이러한 방법론은 면역 세포와의 공동 배양 및 콜라겐 침습 분석을 통한 생체 외 전이 모델링과 같은 무수한 다운스트림 분석에 적합합니다. 이러한 분석은 세포-세포 거동을 더 잘 설명하고 종양 미세 환경 내의 상호 작용에 대한 보다 완전한 이해를 만드는 데 도움이 됩니다.
Introduction
시험관 내에서 상피 세포를 모델링하는 능력은 생체 내에서 접근할 수 없는 세포 특징을 포착하기 때문에 현대 생물 의학 연구의 기초가 되었습니다. 예를 들어, 2차원 평면에서 상피 세포주를 성장시키면 증식 동안 상피 세포에서 발생하는 분자 변화를 평가할 수 있다1. 또한, 신호전달과 유전자 발현 사이의 동적 조절을 측정하는 것은 생체 내 시스템에서 제한적이다2. 암 연구에서, 암 상피 세포주 모델링은 질병 진행의 분자적 동인과 잠재적인 약물 표적의 식별을 가능하게 했다3. 그러나, 2차원 평면에서 성장하는 암 상피 세포주는 대부분 유전적으로 불멸화되고 변형되며, 종종 본질적으로 클론성이며, 비생리학적 조건에서 성장할 수 있는 능력으로 선택되고, 3차원(3D) 종양 조직 구조에 대한 평가가 제한되며, 현실적인 조직 환경 내에서 미세 환경 상호작용을 적절하게 모델링하지 못하기 때문에 한계가 있다4. 이러한 제약은 전이를 모델링할 때 특히 뚜렷하게 나타나는데, 이는 생체 내에서 먼 장기 부위의 침입, 파종, 순환 및 집락화를 포함한 몇 가지 뚜렷한 생물학적 단계를 포함한다5.
암 상피 오가노이드는 종양의 3D 환경과 거동을 더 잘 요약하기 위해 개발되었습니다 6,7,8. 오가노이드는 단일 LRG5+ 장 섬와(intestinal cryptinal cell)에서 처음 개발되었으며, 시험관 내 소장의 계층적 구조를 유지하는 섬와-융모 단위(orbit-villus unit)의 3D 구조를 나타내기 위해 분화되었다 9. 이 접근 방식은 항상성 및 스트레스 조건에서 자기 조직화 조직 구조의 실시간 시각화 및 특성화를 허용했습니다. 자연적인 확장으로 암 상피 오가노이드는 결장직장암 10, 췌장암 11, 유방암 12, 간 13, 폐암14, 뇌암 15 및 위암 16을 포함한 다양한 암 유형을 모델링하기 위해 개발되었습니다. 암 상피 오가노이드는 암 진화17,18 및 전이성 시공간 행동 19,20을 특성화하고 종양 이질성 21을 조사하고 화학 요법 22를 검사하기 위해 이용되었습니다. 암 상피 오가노이드는 또한 생체 외 항암제 및 방사선 요법에 대한 환자 반응을 예측하기 위해 진행 중인 임상 시험 동안 분리 및 수집되었습니다 8,23,24,25. 또한, 암 상피 오가노이드를 포함하는 시스템은 면역 세포와 같은 다른 비암 세포와 결합하여 종양 미세 환경의 보다 포괄적인 모델을 형성하여 실시간으로 상호 작용을 시각화하고, 암 상피 세포가 자연 살해 세포와 같은 세포독성 이펙터 면역 세포의 근본적인 특성을 어떻게 변화시키는지 밝히고, 잠재적인 면역 요법 및 항체 약물 의존성 세포독성 활성을 테스트할 수 있습니다26. 27,28. 이 기사는 콜라겐 및 기저 세포외 기질(ECM)에 계대 및 포매 없이 상피 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 또한 분리된 오가노이드의 다운스트림 이미징 기술도 공유됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 오가노이드를 생성하기 위한 상이한 방법이 문헌에 기재되어 있다. 이 프로토콜은 계대시지 없이 종양으로부터 직접 종양 오가노이드를 생성하는 방법을 강조합니다. 이 방법을 사용하면 종양 오가노이드가 시술 시작 후 몇 시간 내에 생성될 수 있으며 문헌31에 보고된 70%에 비해 100%에 가까운 생존 가능한 오가노이드를 생성합니다. 이에 비해 다른 방법은 몇 주에 걸쳐 세?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation 및 NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543에서 제공한 자금의 지원을 받았습니다. 우리는 수상 번호 P30 CA142543에 따라 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에서 부분적으로 지원하는 Simmons Comprehensive Cancer Center의 공유 리소스인 University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource의 도움을 인정합니다. Chan Lab의 모든 구성원에게 특별한 감사를드립니다.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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