הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר
Summary
פרוטוקול זה דן בגישה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים מרקמת חלב ראשונית נורמלית וגידולית באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. יתר על כן, הוראות כלולות עבור תרבית תלת מימדית, כמו גם הדמיה immunofluorescent של אורגנואידים משובצים.
Abstract
אורגנואידים הם שיטה אמינה למידול רקמת איברים בשל תכונות הארגון העצמי שלהם ושמירה על תפקוד וארכיטקטורה לאחר התפשטות מרקמה ראשונית או תאי גזע. שיטה זו של יצירת אורגנואידים מוותרת על התמיינות של תא בודד דרך מעברים מרובים ובמקום זאת משתמשת בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד אורגנואידים אפיתל חלב מרקמות מנותקות מכנית ואנזימטית. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה לייצור מהיר של אורגנואידים אפיתליאליים קטנים וגדולים מרקמת חלב עכברית ואנושית, בנוסף לטכניקות להטמעת אורגנואידים בקולגן ובמטריצה חוץ-תאית במרתף. יתר על כן, הוראות לקיבוע בג’ל וצביעה אימונופלואורסצנטית ניתנות לצורך הדמיה של מורפולוגיה וצפיפות אורגנואידים. מתודולוגיות אלה מתאימות למספר עצום של ניתוחים במורד הזרם, כגון תרבית משותפת עם תאי מערכת החיסון ומידול גרורות ex vivo באמצעות בדיקת פלישה לקולגן. ניתוחים אלה משמשים להבהרה טובה יותר של התנהגות התא וליצירת הבנה מלאה יותר של אינטראקציות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול.
Introduction
היכולת למדל תאי אפיתל במבחנה הייתה הבסיס למחקר הביו-רפואי המודרני מכיוון שהיא לוכדת תכונות תאיות שאינן נגישות in vivo. לדוגמה, גידול קווי תאי אפיתל במישור דו-ממדי יכול לספק הערכה של השינויים המולקולריים המתרחשים בתא אפיתל במהלך התפשטות1. יתר על כן, מדידת הוויסות הדינמי בין איתות לביטוי גנים מוגבלת במערכות in vivo 2. בחקר הסרטן, מידול קו תאי אפיתל של סרטן איפשר זיהוי של מניעים מולקולריים של התקדמות המחלה ומטרות פוטנציאליות של תרופות3. עם זאת, לגידול קווי תאי אפיתל סרטניים במישור דו-ממדי יש מגבלות, שכן רובם עברו אימורטליזציה גנטית והונדסה, לעתים קרובות משובטים בטבע, שנבחרו בשל יכולתם לגדול בתנאים לא פיזיולוגיים, מוגבלים בהערכתם את ארכיטקטורת רקמת הגידול התלת-ממדית (3D), ואינם מודלים כראוי אינטראקציות מיקרו-סביבה בסביבת רקמה מציאותית4. אילוצים אלה בולטים במיוחד במידול גרורות, אשר in vivo כולל כמה שלבים ביולוגיים ברורים, כולל פלישה, הפצה, מחזור והתיישבות באתר האיברים המרוחק5.
אורגנואידים אפיתל לסרטן פותחו כדי לשחזר טוב יותר את הסביבה התלת-ממדית ואת ההתנהגות של גידולים 6,7,8. אורגנואידים פותחו לראשונה מתאי קריפטה בודדים של המעי LRG5+ והתמיינו כדי לייצג את המבנה התלת-ממדי של יחידות קריפטו-וילוס ששמרו על המבנה ההיררכי של המעי הדק במבחנה9. גישה זו אפשרה הדמיה בזמן אמת ואפיון של ארכיטקטורת רקמות המארגנת את עצמה בתנאי הומיאוסטטיקה ולחץ. כהרחבה טבעית, אורגנואידים אפיתליאליים של סרטן פותחו כדי למדל סוגי סרטן רבים ושונים, כולל סרטן המעי הגס 10, לבלב11, שד 12, כבד 13, ריאות 14, מוח 15, וסרטן קיבה 16. אורגנואידים אפיתליאליים של סרטן נוצלו כדי לאפיין אבולוציה של סרטן17,18 והתנהגויות מרחביות-זמניות גרורתיות19,20 ולחקור הטרוגניות של הגידול21, ולבדוק כימותרפיות 22. אורגנואידים אפיתל לסרטן בודדו ונאספו גם במהלך ניסויים קליניים מתמשכים כדי לחזות את תגובת המטופלים לחומרים אנטי-סרטניים והקרנות ex vivo 8,23,24,25. יתר על כן, מערכות המשלבות אורגנואידים אפיתל סרטני יכולות להיות משולבות עם תאים אחרים שאינם סרטניים, כגון תאים חיסוניים, כדי ליצור מודל מקיף יותר של מיקרו-סביבה של הגידול כדי לדמיין אינטראקציות בזמן אמת, לחשוף כיצד תאי אפיתל סרטניים משנים את הטבע הבסיסי של תאים חיסוניים ציטוטוקסיים משפיעים כגון תאי הרג טבעיים, ולבדוק אימונותרפיה פוטנציאלית ופעילות ציטוטוקסית תלוית נוגדנים-תרופות26, 27,28. מאמר זה מדגים שיטה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים ללא מעבר והטבעה בקולגן ובמטריצה חוץ-תאית במרתף (ECM). בנוסף, טכניקות להדמיה במורד הזרם של אורגנואידים מבודדים משותפות גם כן.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות שונות תוארו בספרות ליצירת אורגנואידים סרטניים. פרוטוקול זה מדגיש שיטה ליצירת אורגנואידים סרטניים ישירות מהגידול ללא מעבר. באמצעות שיטה זו, אורגנואידים סרטניים ניתנים לייצור תוך שעות מתחילת ההליך ומייצרים קרוב ל -100% אורגנואידים קיימא לעומת 70% שדווחו בספרות31. לשם השוואה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מימון שסופק על ידי METAvivor, קרן פיטר קרלסון, קרן המחקר של תרזה, ומרכז הסרטן NCI/UTSW סימונס P30 CA142543. אנו מכירים בסיוע של University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, משאב משותף במרכז סימונס לסרטן מקיף, הנתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן תחת פרס מספר P30 CA142543. תודה מיוחדת לכל חברי מעבדת צ’אן.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
Riferimenti
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
