Génération et imagerie d’organoïdes épithéliaux de souris et humains à partir de tissus mammaires normaux et tumoraux sans passage
Summary
Ce protocole traite d’une approche pour générer des organoïdes épithéliaux à partir de tissu mammaire primaire normal et tumoral par centrifugation différentielle. En outre, des instructions sont incluses pour la culture tridimensionnelle ainsi que l’imagerie immunofluorescente des organoïdes intégrés.
Abstract
Les organoïdes sont une méthode fiable pour modéliser les tissus organiques en raison de leurs propriétés auto-organisatrices et de la conservation de la fonction et de l’architecture après la propagation à partir de tissus primaires ou de cellules souches. Cette méthode de génération d’organoïdes renonce à la différenciation unicellulaire par plusieurs passages et utilise plutôt la centrifugation différentielle pour isoler les organoïdes épithéliaux mammaires des tissus dissociés mécaniquement et enzymatiquement. Ce protocole fournit une technique simplifiée pour produire rapidement de petits et grands organoïdes épithéliaux à partir de tissus mammaires de souris et humains, en plus de techniques d’incorporation organoïde dans le collagène et la matrice extracellulaire basale. De plus, des instructions pour la fixation dans le gel et la coloration immunofluorescente sont fournies dans le but de visualiser la morphologie et la densité organoïdes. Ces méthodologies conviennent à une myriade d’analyses en aval, telles que la co-culture avec des cellules immunitaires et la modélisation ex vivo des métastases via un test d’invasion de collagène. Ces analyses servent à mieux élucider le comportement cellule-cellule et à créer une compréhension plus complète des interactions au sein du microenvironnement tumoral.
Introduction
La capacité de modéliser les cellules épithéliales in vitro a été le fondement de la recherche biomédicale moderne, car elle capture des caractéristiques cellulaires qui ne sont pas accessibles in vivo. Par exemple, la croissance de lignées cellulaires épithéliales dans un plan bidimensionnel peut fournir une évaluation des changements moléculaires qui se produisent dans une cellule épithéliale pendant la prolifération1. De plus, la mesure de la régulation dynamique entre la signalisation et l’expression génique est limitée dans les systèmes in vivo 2. Dans la recherche sur le cancer, la modélisation des lignées cellulaires épithéliales cancéreuses a permis d’identifier les facteurs moléculaires de progression de la maladie et les cibles médicamenteuses potentielles3. Cependant, la croissance de lignées cellulaires épithéliales cancéreuses sur un plan bidimensionnel a des limites, car la plupart sont génétiquement immortalisées et modifiées, souvent de nature clonale, sélectionnées pour leur capacité à se développer dans des conditions non physiologiques, limitées dans leur évaluation de l’architecture tridimensionnelle (3D) des tissus tumoraux, et ne modélisent pas adéquatement les interactions du microenvironnement dans un environnement tissulaire réaliste4. Ces contraintes sont particulièrement évidentes dans la modélisation des métastases, qui comprend in vivo plusieurs étapes biologiques distinctes, y compris l’invasion, la dissémination, la circulation et la colonisation sur le site d’organes éloigné5.
Des organoïdes épithéliaux cancéreux ont été développés pour mieux récapituler l’environnement 3D et le comportement des tumeurs 6,7,8. Les organoïdes ont d’abord été développés à partir de cellules cryptiques intestinales LRG5+ uniques et différenciés pour représenter la structure 3D des unités cryptes-villosités qui maintenaient la structure hiérarchique de l’intestin grêle in vitro9. Cette approche a permis de visualiser et de caractériser en temps réel l’architecture tissulaire auto-organisatrice dans des conditions homéostatiques et de stress. En tant qu’extension naturelle, les organoïdes épithéliaux du cancer ont été développés pour modéliser de nombreux types de cancer différents, y compris colorectal 10, pancréatique11, sein 12, foie13, poumon 14, cerveau 15 et gastrique 16. Les organoïdes épithéliaux du cancer ont été exploités pour caractériser l’évolution du cancer17,18 et les comportements spatio-temporels métastatiques19,20 et interroger l’hétérogénéité tumorale21, et tester les chimiothérapies 22. Des organoïdes épithéliaux cancéreux ont également été isolés et collectés au cours d’essais cliniques en cours pour prédire la réponse des patients aux agents anticancéreux et à la radiothérapie ex vivo 8,23,24,25. En outre, les systèmes incorporant des organoïdes épithéliaux cancéreux peuvent être combinés avec d’autres cellules non cancéreuses, telles que les cellules immunitaires, pour former un modèle plus complet du microenvironnement tumoral afin de visualiser les interactions en temps réel, de découvrir comment les cellules épithéliales cancéreuses modifient la nature fondamentale des cellules immunitaires effectrices cytotoxiques telles que les cellules tueuses naturelles, et de tester les immunothérapies potentielles et l’activité cytotoxique dépendante des anticorps26, 27,28. Cet article démontre une méthode de génération d’organoïdes épithéliaux sans passer et incorporer dans le collagène et la matrice extracellulaire basale (ECM). En outre, des techniques d’imagerie en aval d’organoïdes isolés sont également partagées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentes méthodes ont été décrites dans la littérature pour générer des organoïdes tumoraux. Ce protocole met en évidence une méthode permettant de générer des organoïdes tumoraux directement à partir de la tumeur sans passer. En utilisant cette méthode, les organoïdes tumoraux sont productibles dans les heures suivant le début de la procédure et génèrent près de 100% d’organoïdes viables contre 70% rapportés dans la littérature31. En comparaison, d’autres méthodes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par METAvivor, le Peter Carlson Trust, la Theresa’s Research Foundation et le NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Nous remercions l’aide de la Southwestern Tissue Management Shared Resource de l’Université du Texas, une ressource partagée du Simmons Comprehensive Cancer Center, qui est soutenue en partie par le National Cancer Institute sous le numéro d’attribution P30 CA142543. Un merci spécial à tous les membres du Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
Riferimenti
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
