Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi
Summary
Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.
Abstract
Organoidler, kendi kendini organize eden özellikleri ve birincil doku veya kök hücrelerden yayıldıktan sonra fonksiyon ve mimarinin korunması nedeniyle organ dokusunu modellemek için güvenilir bir yöntemdir. Bu organoid üretim yöntemi, çoklu pasajlar yoluyla tek hücreli farklılaşmadan vazgeçer ve bunun yerine meme epitel organoidlerini mekanik ve enzimatik olarak ayrışmış dokulardan izole etmek için diferansiyel santrifüjleme kullanır. Bu protokol, kollajen ve bodrum hücre dışı matrikse organoid gömme tekniklerine ek olarak, hem fare hem de insan meme dokusundan küçük ve büyük epitelyal organoidleri hızlı bir şekilde üretmek için aerodinamik bir teknik sağlar. Ayrıca, organoid morfolojisini ve yoğunluğunu görselleştirmek amacıyla jel içi fiksasyon ve immünofloresan boyama için talimatlar verilmiştir. Bu metodolojiler, bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürleme ve kollajen invazyonu testi yoluyla ex vivo metastaz modellemesi gibi sayısız aşağı akış analizi için uygundur. Bu analizler, hücre-hücre davranışını daha iyi aydınlatmaya ve tümör mikro ortamındaki etkileşimlerin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlamaya hizmet eder.
Introduction
Epitel hücrelerini in vitro olarak modelleme yeteneği, modern biyomedikal araştırmaların temeli olmuştur, çünkü in vivo olarak erişilemeyen hücresel özellikleri yakalar. Örneğin, iki boyutlu bir düzlemde büyüyen epitel hücre çizgileri, proliferasyon1 sırasında bir epitel hücresinde meydana gelen moleküler değişikliklerin bir değerlendirmesini sağlayabilir. Ayrıca, sinyalizasyon ve gen ekspresyonu arasındaki dinamik düzenlemenin ölçülmesi in vivo sistemlerdesınırlıdır 2. Kanser araştırmalarında, kanser epitel hücre hattı modellemesi, hastalığın ilerlemesinin moleküler sürücülerinin ve potansiyel ilaç hedeflerinin tanımlanmasını sağlamıştır3. Bununla birlikte, iki boyutlu bir düzlemde büyüyen kanser epitel hücre hatlarının sınırlamaları vardır, çünkü çoğu genetik olarak ölümsüzleştirilir ve modifiye edilir, genellikle doğada klonaldir, fizyolojik olmayan koşullarda büyüme yetenekleri için seçilir, üç boyutlu (3B) tümör doku mimarisinin değerlendirilmesinde sınırlıdır ve gerçekçi bir doku ortamında mikro çevre etkileşimlerini yeterincemodellememektedir4. Bu kısıtlamalar, in vivo olarak uzak organ bölgesinde invazyon, yayılma, dolaşım ve kolonizasyon dahil olmak üzere birkaç farklı biyolojik aşamayı içeren metastazın modellenmesinde özellikle belirgindir.5.
Kanser epitel organoidleri, tümörlerin 3D ortamını ve davranışlarını daha iyi özetlemek için geliştirilmiştir 6,7,8. Organoidler ilk olarak tek LRG5 + bağırsak kript hücrelerinden geliştirildi ve ince bağırsağın in vitro9’un hiyerarşik yapısını koruyan kript-villus birimlerinin 3D yapısını temsil edecek şekilde farklılaştırıldı. Bu yaklaşım, homeostatik ve stres koşulları altında kendi kendini organize eden doku mimarisinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine ve karakterizasyonuna izin verdi. Doğal bir uzantı olarak, kolorektal10, pankreas 11, meme 12, karaciğer 13, akciğer14, beyin15 ve mide kanserleri 16 dahil olmak üzere birçok farklı kanser türünü modellemek için kanser epitel organoidleri geliştirilmiştir. Kanser epitelyal organoidleri, kanser evrimi 17,18 ve metastatik mekansal zamansal davranışları 19,20 karakterize etmek ve tümör heterojenliğini sorgulamak 21 ve kemoterapileri test etmekiçin kullanılmıştır 22. Kanser epitel organoidleri de antikanser ajanlarına ve radyasyon tedavisine ex vivo 8,23,24,25 hasta yanıtını tahmin etmek için devam eden klinik çalışmalar sırasında izole edilmiş ve toplanmıştır. Ayrıca, kanser epitel organoidlerini içeren sistemler, etkileşimleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek, kanser epitel hücrelerinin doğal öldürücü hücreler gibi sitotoksik efektör bağışıklık hücrelerinin temel doğasını nasıl değiştirdiğini ortaya çıkarmak ve potansiyel immünoterapileri ve antikor-ilaca bağımlı sitotoksik aktiviteyi test etmek için tümör mikro ortamının daha kapsamlı bir modelini oluşturmak için bağışıklık hücreleri gibi diğer kanser dışı hücrelerle birleştirilebilir26, 27,28. Bu makalede, kollajen ve bodrum hücre dışı matrikse (ECM) pasaj yapmadan ve gömülmeden epitel organoidleri üretme yöntemi gösterilmektedir. Ek olarak, izole organoidlerin aşağı akış görüntüleme teknikleri de paylaşılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Literatürde tümör organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlanmıştır. Bu protokol, tümör organoidlerini doğrudan tümörden pasaj olmadan üretmek için bir yöntemi vurgulamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, tümör organoidleri prosedürün başlatılmasından sonraki saatler içinde üretilebilir ve literatürde bildirilen %70’e kıyasla %100’e yakın canlı organoidler üretir31. Buna karşılık, diğer yöntemler hücrelerin birkaç hafta boyunca organoidlere seri geçiş…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation ve NCI / UTSW Simmons Kanser Merkezi P30 CA142543 tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir. Simmons Kapsamlı Kanser Merkezi’nde paylaşılan bir kaynak olan Teksas Üniversitesi Güneybatı Doku Yönetimi Ortak Kaynağı’nın yardımına teşekkür ediyoruz ve kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından P30 CA142543 ödül numarası altında desteklenmektedir. Chan Lab’ın tüm üyelerine özel teşekkürler.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
Riferimenti
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
