Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar
Summary
Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.
Abstract
Los organoides son un método confiable para modelar el tejido orgánico debido a sus propiedades de autoorganización y retención de la función y la arquitectura después de la propagación a partir de tejido primario o células madre. Este método de generación de organoides renuncia a la diferenciación unicelular a través de múltiples pasajes y en su lugar utiliza la centrifugación diferencial para aislar organoides epiteliales mamarios de tejidos disociados mecánica y enzimáticamente. Este protocolo proporciona una técnica simplificada para producir rápidamente organoides epiteliales pequeños y grandes a partir de tejido mamario humano y de ratón, además de técnicas para la incrustación de organoides en colágeno y matriz extracelular basal. Además, se proporcionan instrucciones para la fijación en gel y la tinción inmunofluorescente con el fin de visualizar la morfología y densidad de los organoides. Estas metodologías son adecuadas para innumerables análisis posteriores, como el cocultivo con células inmunes y el modelado de metástasis ex vivo a través del ensayo de invasión de colágeno. Estos análisis sirven para dilucidar mejor el comportamiento célula-célula y crear una comprensión más completa de las interacciones dentro del microambiente tumoral.
Introduction
La capacidad de modelar células epiteliales in vitro ha sido la base de la investigación biomédica moderna porque captura características celulares que no son accesibles in vivo. Por ejemplo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales en un plano bidimensional puede proporcionar una evaluación de los cambios moleculares que ocurren en una célula epitelial durante la proliferación1. Además, la medición de la regulación dinámica entre la señalización y la expresión génica está limitada en los sistemas in vivo 2. En la investigación del cáncer, el modelado de la línea celular epitelial del cáncer ha permitido la identificación de los impulsores moleculares de la progresión de la enfermedad y los posibles objetivos farmacológicos3. Sin embargo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales de cáncer en un plano bidimensional tiene limitaciones, ya que la mayoría son genéticamente inmortalizadas y modificadas, a menudo de naturaleza clonal, seleccionadas por su capacidad para crecer en condiciones no fisiológicas, limitadas en su evaluación de la arquitectura tridimensional (3D) del tejido tumoral, y no modelan adecuadamente las interacciones del microambiente dentro de un entorno tisular realista4. Estas limitaciones son particularmente evidentes en el modelado de metástasis, que in vivo incluye varias etapas biológicas distintas, incluyendo invasión, diseminación, circulación y colonización en el sitio del órgano distante5.
Los organoides epiteliales del cáncer han sido desarrollados para recapitular mejor el ambiente 3D y el comportamiento de los tumores 6,7,8. Los organoides se desarrollaron por primera vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ individuales y se diferenciaron para representar la estructura 3D de las unidades de cripta-vellosidades que mantenían la estructura jerárquica del intestino delgado in vitro9. Este enfoque permitió la visualización y caracterización en tiempo real de la arquitectura tisular autoorganizada en condiciones homeostáticas y de estrés. Como extensión natural, los organoides epiteliales del cáncer se desarrollaron para modelar muchos tipos diferentes de cáncer, incluidos los cánceres colorrectal 10, pancreático11, mama 12, hígado 13, pulmón 14, cerebro 15 y gástrico 16. Los organoides epiteliales del cáncer han sido explotados para caracterizar la evolución del cáncer17,18 y los comportamientos espaciotemporales metastásicos19,20 e interrogar la heterogeneidad tumoral21, y probar quimioterapias 22. Los organoides epiteliales del cáncer también se han aislado y recolectado durante ensayos clínicos en curso para predecir la respuesta del paciente a los agentes anticancerosos y la radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Además, los sistemas que incorporan organoides epiteliales cancerosos pueden combinarse con otras células no cancerosas, como las células inmunes, para formar un modelo más completo del microambiente tumoral para visualizar las interacciones en tiempo real, descubrir cómo las células epiteliales cancerosas cambian la naturaleza fundamental de las células inmunes efectoras citotóxicas, como las células asesinas naturales, y probar posibles inmunoterapias y actividad citotóxica dependiente de anticuerpos26, 27,28. Este artículo demuestra un método para generar organoides epiteliales sin pasar e incrustarse en colágeno y matriz extracelular basal (ECM). Además, también se comparten técnicas para obtener imágenes posteriores de organoides aislados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han descrito diferentes métodos en la literatura para generar organoides tumorales. Este protocolo destaca un método para generar organoides tumorales directamente del tumor sin pasar. Utilizando este método, los organoides tumorales son producibles a las pocas horas de iniciar el procedimiento y generan organoides cerca del 100% viables en comparación con el 70% reportado en la literatura31. En comparación, otros métodos requieren el paso en serie de células a organoides durante varias …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por fondos proporcionados por METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation y el NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Reconocemos la asistencia del recurso compartido de manejo de tejidos del suroeste de la Universidad de Texas, un recurso compartido en el Simmons Comprehensive Cancer Center, que cuenta con el apoyo parcial del Instituto Nacional del Cáncer bajo el número de premio P30 CA142543. Un agradecimiento especial a todos los miembros del Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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