يناقش هذا البروتوكول نهجا لتوليد العضويات الظهارية من الأنسجة الثديية الطبيعية الأولية والأورام من خلال الطرد المركزي التفاضلي. علاوة على ذلك ، يتم تضمين تعليمات للزراعة ثلاثية الأبعاد وكذلك التصوير المناعي للعضويات المدمجة.
تعتبر المواد العضوية طريقة موثوقة لنمذجة أنسجة الأعضاء نظرا لخصائصها ذاتية التنظيم والاحتفاظ بالوظيفة والبنية بعد الانتشار من الأنسجة الأولية أو الخلايا الجذعية. تتخلى طريقة توليد الخلايا العضوية هذه عن تمايز الخلية الواحدة من خلال ممرات متعددة وتستخدم بدلا من ذلك الطرد المركزي التفاضلي لعزل الكائنات العضوية الظهارية الثديية عن الأنسجة المنفصلة ميكانيكيا وإنزيميا. يوفر هذا البروتوكول تقنية مبسطة لإنتاج المواد العضوية الظهارية الصغيرة والكبيرة بسرعة من كل من أنسجة الفئران والأنسجة الثديية البشرية بالإضافة إلى تقنيات التضمين العضوي في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم توفير تعليمات للتثبيت داخل الهلام وتلطيخ الفلورسنت المناعي لغرض تصور مورفولوجيا العضوية وكثافتها. هذه المنهجيات مناسبة لعدد لا يحصى من التحليلات النهائية ، مثل الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية ونمذجة ورم خبيث خارج الجسم الحي عبر مقايسة غزو الكولاجين. تعمل هذه التحليلات على توضيح سلوك الخلايا الخلوية بشكل أفضل وخلق فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات داخل البيئة المكروية للورم.
كانت القدرة على نمذجة الخلايا الظهارية في المختبر أساس البحوث الطبية الحيوية الحديثة لأنها تلتقط الميزات الخلوية التي لا يمكن الوصول إليها في الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن أن توفر خطوط الخلايا الظهارية المتنامية في مستوى ثنائي الأبعاد تقييما للتغيرات الجزيئية التي تحدث في الخلية الظهارية أثناء الانتشار1. علاوة على ذلك ، فإن قياس التنظيم الديناميكي بين الإشارات والتعبير الجيني محدود في أنظمة الجسم الحي 2. في أبحاث السرطان ، مكنت نمذجة خط الخلايا الظهارية السرطانية من تحديد الدوافع الجزيئية لتطور المرض وأهداف الأدوية المحتملة3. ومع ذلك ، فإن نمو خطوط الخلايا الظهارية السرطانية على مستوى ثنائي الأبعاد له قيود ، حيث أن معظمها يتم تخليده وتعديله وراثيا ، وغالبا ما يكون نسيليا بطبيعته ، ويتم اختياره لقدرته على النمو في ظروف غير فسيولوجية ، ومحدود في تقييمه لبنية أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد (3D) ، ولا يقوم بنمذجة تفاعلات البيئة المكروية بشكل كاف داخل بيئة أنسجة واقعية4. هذه القيود واضحة بشكل خاص في نمذجة ورم خبيث ، والذي يتضمن في الجسم الحي عدة مراحل بيولوجية متميزة ، بما في ذلك الغزو والانتشار والدورة الدموية والاستعمار في موقع العضو البعيد5.
تم تطوير الكائنات العضوية الظهارية للسرطان لتلخيص بيئة 3D وسلوك الأورام6،7،8 بشكل أفضل. تم تطوير المواد العضوية لأول مرة من خلايا سرداب معوية LRG5 + مفردة ومتباينة لتمثيل البنية ثلاثية الأبعاد لوحدات crypt-villus التي حافظت على الهيكل الهرمي للأمعاء الدقيقة في المختبر9. سمح هذا النهج بالتصور والتوصيف في الوقت الفعلي لبنية الأنسجة ذاتية التنظيم في ظل ظروف الاستتباب والإجهاد. كامتداد طبيعي ، تم تطوير العضويات الظهارية للسرطان لنمذجة العديد من أنواع السرطان المختلفة ، بما في ذلك القولون والمستقيم 10 ، والبنكرياس 11 ، والثدي 12 ، والكبد 13 ، والرئة 14 ، والدماغ 15 ، وسرطان المعدة 16. تم استغلال العضويات الظهارية السرطانية لتوصيف تطور السرطان17,18 والسلوكيات الزمانية المكانيةالنقيلي 19,20 واستجواب عدم تجانس الورم 21 ، واختبار العلاجات الكيميائية 22. كما تم عزل الكائنات العضوية الظهارية للسرطان وجمعها خلال التجارب السريرية الجارية للتنبؤ باستجابة المريض للعوامل المضادة للسرطان والعلاج الإشعاعي خارج الجسم الحي8،23،24،25. علاوة على ذلك ، يمكن دمج الأنظمة التي تتضمن عضويات ظهارية سرطانية مع خلايا أخرى غير سرطانية ، مثل الخلايا المناعية ، لتشكيل نموذج أكثر شمولا للبيئة المكروية للورم لتصور التفاعلات في الوقت الفعلي ، والكشف عن كيفية تغيير الخلايا الظهارية السرطانية للطبيعة الأساسية للخلايا المناعية المستجيبة السامة للخلايا مثل الخلايا القاتلة الطبيعية ، واختبار العلاجات المناعية المحتملة والنشاط السام للخلايا المعتمد على الأجسام المضادة26 ، 27,28. توضح هذه المقالة طريقة لتوليد المواد العضوية الظهارية دون المرور والتضمين في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية (ECM). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا مشاركة تقنيات التصوير النهائي للعضويات المعزولة.
تم وصف طرق مختلفة في الأدبيات لتوليد عضويات الورم. يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتوليد عضويات الورم مباشرة من الورم دون المرور. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن إنتاج عضويات الورم في غضون ساعات من بدء الإجراء وتوليد ما يقرب من 100٪ من المواد العضوية القابلة للحياة مقارنة ب 70٪ المبلغ عنها ?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة بتمويل مقدم من METAvivor ، و Peter Carlson Trust ، ومؤسسة أبحاث تيريزا ، ومركز NCI/UTSW Simmons للسرطان P30 CA142543. نحن نعترف بمساعدة المورد المشترك لإدارة الأنسجة بجامعة تكساس الجنوبية الغربية ، وهو مورد مشترك في مركز سيمونز الشامل للسرطان ، والذي يدعمه جزئيا المعهد الوطني للسرطان بموجب رقم الجائزة P30 CA142543. شكر خاص لجميع أعضاء مختبر تشان.
10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
10x DMEM | Sigma | D2429 | |
50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
bFGF | Sigma | F0291 | |
BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
Collagenase A | Sigma | C2139 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
Insulin | Sigma | #I9278 | |
Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |