Evaluatie van antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken in vitro
Summary
We introduceren vier methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te evalueren met behulp van in vitro technieken. Deze methoden kunnen worden aangepast om de interacties van verschillende nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken met een breed scala aan microbiële soorten te bestuderen.
Abstract
De antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken, zoals zilver, zinkoxide, titaniumdioxide en magnesiumoxide, zijn eerder onderzocht in klinische en omgevingsomgevingen en in verbruiksartikelen. Een gebrek aan consistentie in de gebruikte experimentele methoden en materialen heeft echter geleid tot tegenstrijdige resultaten, zelfs tussen studies van dezelfde nanostructuurtypen en bacteriesoorten. Voor onderzoekers die nanostructuren willen gebruiken als additief of coating in een productontwerp, beperken deze tegenstrijdige gegevens hun gebruik in klinische omgevingen.
Om dit dilemma het hoofd te bieden, presenteren we in dit artikel vier verschillende methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te bepalen en bespreken we hun toepasbaarheid in verschillende scenario’s. Het aanpassen van consistente methoden zal naar verwachting leiden tot reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen studies en geïmplementeerd voor verschillende nanostructuurtypen en microbiële soorten. We introduceren twee methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes te bepalen en twee methoden voor de antimicrobiële activiteiten van nanogestructureerde oppervlakken.
Voor nanodeeltjes kan de directe cocultuurmethode worden gebruikt om de minimale remmende en minimale bacteriedodende concentraties van nanodeeltjes te bepalen, en de directe blootstellingscultuurmethode kan worden gebruikt om real-time bacteriostatische versus bacteriedodende activiteit als gevolg van blootstelling aan nanodeeltjes te beoordelen. Voor nanogestructureerde oppervlakken wordt de directe kweekmethode gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën indirect en direct in contact met nanogestructureerde oppervlakken te bepalen, en de methode voor gerichte contactblootstelling wordt gebruikt om antimicrobiële activiteit op een specifiek gebied van een nanogestructureerd oppervlak te onderzoeken. We bespreken de belangrijkste experimentele variabelen waarmee rekening moet worden gehouden voor in vitro onderzoeksontwerp bij het bepalen van de antimicrobiële eigenschappen van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken. Al deze methoden zijn relatief goedkoop, maken gebruik van technieken die relatief gemakkelijk te beheersen en herhaalbaar zijn voor consistentie, en zijn toepasbaar op een breed scala aan nanostructuurtypen en microbiële soorten.
Introduction
Alleen al in de VS ontwikkelen jaarlijks 1,7 miljoen mensen een ziekenhuisinfectie (HAI), waarbij één op de 17 van deze infecties resulteert in de dood1. Bovendien wordt geschat dat de behandelingskosten voor zorginfecties variëren van $ 28 miljard tot $ 45 miljard per jaar 1,2. Deze zorginfecties worden gedomineerd door methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 en Pseudomonas aeruginosa4, die vaak geïsoleerd zijn van chronische wondinfecties en meestal uitgebreide behandeling en tijd nodig hebben om een gunstig patiëntresultaat te produceren.
In de afgelopen decennia zijn meerdere antibioticaklassen ontwikkeld om infecties te behandelen die verband houden met deze en andere pathogene bacteriën. Rifamycine-analogen zijn bijvoorbeeld gebruikt voor de behandeling van MRSA, andere grampositieve en gramnegatieve infecties en Mycobacterium spp. infecties5. In de jaren 1990, om een toenemend aantal M. tuberculosis-infecties effectief te behandelen, werden aanvullende geneesmiddelen gecombineerd met rifamycine-analogen om hun effectiviteit te vergroten. Ongeveer 5% van de gevallen van M. tuberculosis blijft echter resistent tegenrifampicine 5,6 en er is toenemende bezorgdheid over multiresistente bacteriën7. Momenteel is het gebruik van antibiotica alleen mogelijk niet voldoende bij de behandeling van zorginfecties, en dit heeft geleid tot een voortdurende zoektocht naar alternatieve antimicrobiële therapieën1.
Zware metalen, zoals zilver (Ag)8,9,10 en goud (Au)11, en keramiek, zoals titaandioxide (TiO 2)12 en zinkoxide (ZnO)13, in nanodeeltjes (NP) vorm (respectievelijk AgNP, AuNP, TiO2 NP en ZnONP) zijn onderzochtop hun antimicrobiële activiteiten en zijn geïdentificeerd als potentiële antibioticaalternatieven. Daarnaast zijn bioresorbeerbare materialen, zoals magnesiumlegeringen (Mg-legeringen)14,15,16, magnesiumoxide nanodeeltjes 17,18,19,20,21, en magnesiumhydroxide nanodeeltjes [nMgO en nMg(OH)2, respectievelijk]22,23,24, zijn ook onderzocht. De eerdere antimicrobiële studies van nanodeeltjes gebruikten echter inconsistente materialen en onderzoeksmethoden, wat resulteerde in gegevens die moeilijk of onmogelijk te vergelijken zijn en soms tegenstrijdig van aard zijn18,19. De minimale remmende concentratie (MIC) en de minimale bacteriedodende concentratie (MBC) van zilveren nanodeeltjes varieerden bijvoorbeeld aanzienlijk in verschillende onderzoeken. Ipe et al.25 evalueerden de antibacteriële activiteiten van AgNP’s met een gemiddelde deeltjesgrootte van ~26 nm om de MIC’s te bepalen tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën. De geïdentificeerde MIC’s voor P. aeruginosa, E. coli, S. aureus en MRSA waren respectievelijk 2 μg / ml, 5 μg / ml, 10 μg / ml en 10 μg / ml. Parvekar et al.26 evalueerden daarentegen AgNP’s met een gemiddelde deeltjesgrootte van 5 nm. In dit geval bleken de AgNP MIC en een MBC van 0,625 mg/ml effectief te zijn tegen S. aureus. Daarnaast evalueerden Loo et al.27 AgNP’s met een grootte van 4,06 nm. Wanneer E. coli werd blootgesteld aan deze nanodeeltjes, werden de MIC en MBC gerapporteerd bij 7,8 μg / ml. Ten slotte onderzochten Ali et al.28 de antibacteriële eigenschappen van bolvormige AgNP’s met een gemiddelde grootte van 18 nm. Wanneer P. aeruginosa, E. coli en MRSA werden blootgesteld aan deze nanodeeltjes, werd de MIC geïdentificeerd bij respectievelijk 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml en 36 μg / ml, en de MBC werd geïdentificeerd bij respectievelijk 36 μg / ml, 42 μg / ml en 30 μg / ml.
Hoewel de antibacteriële activiteit van nanodeeltjes de afgelopen decennia uitgebreid is bestudeerd en gerapporteerd, is er geen standaard voor de gebruikte materialen en onderzoeksmethoden om directe vergelijkingen tussen studies mogelijk te maken. Om deze reden presenteren we twee methoden, de directe co-cultuurmethode (methode A) en de directe blootstellingsmethode (methode B), om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes te karakteriseren en te vergelijken, terwijl de materialen en methoden consistent blijven.
Naast nanodeeltjes zijn ook nanogestructureerde oppervlakken onderzocht op antibacteriële activiteiten. Deze omvatten op koolstof gebaseerde materialen, zoals grafeen nanosheets, koolstofnanobuizen en grafiet29, evenals pure Mg- en Mg-legeringen. Elk van deze materialen heeft ten minste één antibacterieel mechanisme vertoond, waaronder fysieke schade aan celmembranen door op koolstof gebaseerde materialen en schade aan metabole processen of DNA door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) wanneer Mg wordt afgebroken. Bovendien, wanneer zink (Zn) en calcium (Ca) worden gecombineerd bij de vorming van Mg-legeringen, wordt de verfijning van de Mg-matrixkorrelgrootte verbeterd, wat leidt tot een vermindering van bacteriële hechting aan substraatoppervlakken in vergelijking met Mg-only monsters14. Om antibacteriële activiteit aan te tonen, presenteren we de directe kweekmethode (methode C), die bacteriële hechting op en rond nanogestructureerde materialen in de loop van de tijd bepaalt door de kwantificering van bacteriële kolonievormende eenheden (CFU’s) met direct en indirect oppervlaktecontact.
De geometrie van nanostructuren op oppervlakken, inclusief de grootte, vorm en oriëntatie, kan de bacteriedodende activiteiten van materialen beïnvloeden. Lin et al.16 fabriceerden bijvoorbeeld verschillende nanogestructureerde MgO-lagen op de oppervlakken van Mg-substraten door anodisatie en elektroforetische depositie (EPD). Na een periode van blootstelling aan het nanogestructureerde oppervlak in vitro was de groei van S. aureus aanzienlijk verminderd in vergelijking met niet-behandeld Mg. Dit duidde op een grotere potentie van het nanogestructureerde oppervlak tegen bacteriële hechting ten opzichte van het niet-behandelde metallische Mg-oppervlak. Om de verschillende mechanismen van de antibacteriële eigenschappen van verschillende nanogestructureerde oppervlakken te onthullen, wordt in dit artikel een gerichte contactblootstellingsmethode (methode D) besproken die de cel-oppervlakte-interacties binnen het interessegebied bepaalt.
Het doel van dit artikel is om vier in vitro methoden te presenteren die van toepassing zijn op verschillende nanodeeltjes, nanogestructureerde oppervlakken en microbiële soorten. We bespreken de belangrijkste overwegingen voor elke methode om consistente, reproduceerbare gegevens voor vergelijkbaarheid te produceren. In het bijzonder worden de directe cocultuurmethode17 en de directe blootstellingsmethode gebruikt voor het onderzoeken van de antimicrobiële eigenschappen van nanodeeltjes. Door middel van de directe co-cultuur methode kunnen de minimale remmende en minimale bacteriedodende concentraties (respectievelijk MIC en MBC 90-99,99) voor individuele soorten worden bepaald en kan de krachtigste concentratie (MPC) voor meerdere soorten worden bepaald. Door de directe blootstellingsmethode kunnen de bacteriostatische of bacteriedodende effecten van nanodeeltjes bij minimale remmende concentraties worden gekenmerkt door real-time optische dichtheidsmetingen in de loop van de tijd. De direct culture14 methode is geschikt voor het onderzoeken van bacteriën die direct en indirect in contact komen met nanogestructureerde oppervlakken. Ten slotte wordt de focused-contactexposure 16-methode gepresenteerd om de antibacteriële activiteit van een specifiek gebied op een nanogestructureerd oppervlak te onderzoeken door de directe toepassing van bacteriën en de karakterisering van bacteriegroei op de cel-nanostructuurinterface. Deze methode is aangepast van de Japanse industriële standaard JIS Z 2801:200016 en is bedoeld om zich te concentreren op microbe-oppervlakte-interacties en de effecten van bulkmonsterafbraak in microbiële cultuur op antimicrobiële activiteiten uit te sluiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben vier in vitro methoden (A-D) gepresenteerd om de antibacteriële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te karakteriseren. Hoewel elk van deze methoden de groei en levensvatbaarheid van bacteriën in de loop van de tijd kwantificeert als reactie op nanomaterialen, bestaat er enige variatie in de methoden die worden gebruikt om de initiële bacteriële zaaidichtheid, groei en levensvatbaarheid in de loop van de tijd te meten. Drie van deze methoden, de directe cocultuurmethode…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs waarderen de financiële steun van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 en NSF PIRE 1545852), de National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, de Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) en de UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant toegekend aan Patricia Holt-Torres. De auteurs waarderen de hulp van de Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) bij UC-Riverside voor het gebruik van SEM / EDS en Dr. Perry Cheung voor het gebruik van XRD. De auteurs willen ook Morgan Elizabeth Nator en Samhitha Tumkur bedanken voor hun hulp bij de experimenten en data-analyses. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation of de National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
Riferimenti
- Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections – An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
- O’Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
- Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
- Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
- Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
- Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
- Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
- Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
- Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
- Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
- Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
- Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
- Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
- Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
- Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
- Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
- Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
- Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
- He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
- Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
- Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
- Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
- Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
- Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
- Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
- Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
- Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
- Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
- Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
- MTI Corporation. . 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18″x16″x18″, 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) – BPG-7082. , (2022).
- CHEBI. . Tris (CHEBI:9754). , (2023).
- . Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
- Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
- Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
- Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions – Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
- Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
- Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
- Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
- Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).
