Evaluierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen in vitro

Summary

Wir stellen vier Methoden vor, um die antimikrobielle Aktivität von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen mit Hilfe von in vitro Techniken zu bewerten. Diese Methoden können angepasst werden, um die Wechselwirkungen verschiedener Nanopartikel und nanostrukturierter Oberflächen mit einem breiten Spektrum mikrobieller Spezies zu untersuchen.

Abstract

Die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen wie Silber, Zinkoxid, Titandioxid und Magnesiumoxid wurden bereits in klinischen und umweltbedingten Umgebungen sowie in konsumierbaren Lebensmitteln untersucht. Mangelnde Konsistenz in den verwendeten experimentellen Methoden und Materialien hat jedoch zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt, selbst bei Studien mit denselben Nanostrukturtypen und Bakterienarten. Für Forscher, die Nanostrukturen als Additiv oder Beschichtung in einem Produktdesign einsetzen möchten, schränken diese widersprüchlichen Daten ihre Verwendung im klinischen Umfeld ein.

Um diesem Dilemma zu begegnen, stellen wir in diesem Artikel vier verschiedene Methoden vor, um die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu bestimmen, und diskutieren ihre Anwendbarkeit in verschiedenen Szenarien. Es wird erwartet, dass die Anpassung konsistenter Methoden zu reproduzierbaren Daten führt, die studienübergreifend verglichen und für verschiedene Nanostrukturtypen und mikrobielle Spezies implementiert werden können. Wir stellen zwei Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von Nanopartikeln und zwei Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von nanostrukturierten Oberflächen vor.

Für Nanopartikel kann die direkte Co-Kultur-Methode verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen und minimalen bakteriziden Konzentrationen von Nanopartikeln zu bestimmen, und die direkte Expositionskulturmethode kann verwendet werden, um die bakteriostatische und bakterizide Aktivität in Echtzeit zu bewerten, die sich aus der Exposition gegenüber Nanopartikeln ergibt. Bei nanostrukturierten Oberflächen wird die Direktkulturmethode verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien indirekt und direkt in Kontakt mit nanostrukturierten Oberflächen zu bestimmen, und die Methode der fokussierten Kontaktexposition wird verwendet, um die antimikrobielle Aktivität auf einem bestimmten Bereich einer nanostrukturierten Oberfläche zu untersuchen. Wir diskutieren die wichtigsten experimentellen Variablen, die für das in vitro Studiendesign bei der Bestimmung der antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu berücksichtigen sind. Alle diese Methoden sind relativ kostengünstig, verwenden Techniken, die relativ einfach zu beherrschen und aus Gründen der Konsistenz wiederholbar sind, und sind auf ein breites Spektrum von Nanostrukturtypen und mikrobiellen Spezies anwendbar.

Introduction

Allein in den USA entwickeln jährlich 1,7 Millionen Menschen eine im Krankenhaus erworbene Infektion (HAI), wobei eine von 17 dieser Infektionen zum Tod führt¹. Darüber hinaus werden die Behandlungskosten für therapieassoziierte Infektionen auf 28 bis 45 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt ^1,2. Bei diesen therapieassoziierten Infektionen dominieren Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)^3,4 und Pseudomonas aeruginosa^4, die häufig aus chronischen Wundinfektionen isoliert werden und in der Regel eine umfangreiche Behandlung und Zeit erfordern, um ein günstiges Patientenergebnis zu erzielen.

In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Antibiotikaklassen entwickelt, um Infektionen im Zusammenhang mit diesen und anderen pathogenen Bakterien zu behandeln. Zum Beispiel wurden Rifamycin-Analoga zur Behandlung von MRSA, anderen grampositiven und gramnegativen Infektionen und Mycobacterium spp.-Infektionen eingesetzt⁵. In den 1990er Jahren wurden zusätzliche Medikamente mit Rifamycin-Analoga kombiniert, um eine zunehmende Zahl von M. tuberculosis-Infektionen wirksam zu behandeln, um deren Wirksamkeit zu erhöhen. Etwa 5 % der Fälle von M. tuberculosis sind jedoch nach wie vor resistent gegenRifampicin^5,6, und es gibt zunehmende Besorgnis über multiresistente Bakterien⁷. Derzeit ist der Einsatz von Antibiotika allein bei der Behandlung von therapieassoziierten Infektionen möglicherweise nicht ausreichend, was zu einer anhaltenden Suche nach alternativen antimikrobiellen Therapien geführt hat¹.

Schwermetalle wie Silber (Ag)8,9,10 und Gold (Au)11 sowie Keramiken wie Titandioxid (_{TiO 2})12 und Zinkoxid (ZnO)¹³ in Form von Nanopartikeln (NP) (AgNP, AuNP, ^TiO2 NP bzw. ZnONP) wurden aufihre antimikrobielle Aktivität untersucht und als potenzielle antibiotische Alternativen identifiziert. Darüber hinaus sind bioresorbierbare Materialien wie Magnesiumlegierungen (Mg-Legierungen)14,15,16, Magnesiumoxid-Nanopartikel 17,18,19,20,21 und Magnesiumhydroxid-Nanopartikel [nMgO bzw. nMg(OH)₂]^22,23,24, wurden ebenfalls untersucht. In den bisherigen antimikrobiellen Studien zu Nanopartikeln wurden jedoch uneinheitliche Materialien und Forschungsmethoden verwendet, was zu Daten führte, die schwer oder gar nicht vergleichbar sind und manchmal widersprüchlicher Natur sind^18,19. So variierten beispielsweise die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzentration (MBC) von Silbernanopartikeln in verschiedenen Studien signifikant. Ipe et ^al.25 untersuchten die antibakterielle Aktivität von AgNPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von ~26 nm, um die MICs gegen grampositive und gramnegative Bakterien zu bestimmen. Die identifizierten MICs für P. aeruginosa, E. coli, S. aureus und MRSA betrugen 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml bzw. 10 μg/ml. Im Gegensatz dazu untersuchten Parvekar et ^al.26 AgNPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 5 nm. In diesem Fall erwiesen sich die AgNP MHK und ein MBC von 0,625 mg/ml als wirksam gegen S. aureus. Darüber hinaus untersuchten Loo et ^al.27 AgNPs mit einer Größe von 4,06 nm. Wenn E. coli diesen Nanopartikeln ausgesetzt wurde, wurden MHK und MBC mit 7,8 μg/ml angegeben. Schließlich untersuchten Ali et ^al.28 die antibakteriellen Eigenschaften von sphärischen AgNPs mit einer durchschnittlichen Größe von 18 nm. Wenn P. aeruginosa, E. coli und MRSA diesen Nanopartikeln ausgesetzt wurden, wurde die MHK bei 27 μg/ml, 36 μg/ml, 27 μg/ml bzw. 36 μg/ml und die MBC bei 36 μg/ml, 42 μg/ml bzw. 30 μg/ml identifiziert.

Obwohl die antibakterielle Aktivität von Nanopartikeln in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht und berichtet wurde, gibt es keinen Standard für die verwendeten Materialien und Forschungsmethoden, um direkte Vergleiche zwischen Studien zu ermöglichen. Aus diesem Grund stellen wir zwei Methoden vor, die direkte Co-Kultur-Methode (Methode A) und die direkte Expositionsmethode (Methode B), um die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln zu charakterisieren und zu vergleichen und gleichzeitig die Materialien und Methoden konsistent zu halten.

Neben Nanopartikeln wurden auch nanostrukturierte Oberflächen auf antibakterielle Aktivitäten untersucht. Dazu gehören kohlenstoffbasierte Materialien wie Graphen-Nanoblätter, Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphit²⁹ sowie reines Mg und Mg-Legierungen. Jedes dieser Materialien hat mindestens einen antibakteriellen Mechanismus gezeigt, einschließlich physikalischer Schäden, die Zellmembranen durch kohlenstoffbasierte Materialien auferlegt werden, und Schäden an Stoffwechselprozessen oder DNA durch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beim Abbau von Mg. Wenn Zink (Zn) und Calcium (Ca) bei der Bildung von Mg-Legierungen kombiniert werden, wird außerdem die Verfeinerung der Korngröße der Mg-Matrix verbessert, was zu einer Verringerung der bakteriellen Adhäsion an Substratoberflächen im Vergleich zu reinen Mg-Proben führt¹⁴. Um die antibakterielle Aktivität zu demonstrieren, stellen wir die Direktkulturmethode (Methode C) vor, die die bakterielle Adhäsion auf und um nanostrukturierte Materialien über die Zeit durch die Quantifizierung von bakteriellen koloniebildenden Einheiten (KBE) mit direktem und indirektem Oberflächenkontakt bestimmt.

Die Geometrie von Nanostrukturen auf Oberflächen, einschließlich der Größe, Form und Ausrichtung, könnte die bakterizide Aktivität von Materialien beeinflussen. Zum Beispiel stellten Lin et ^al.16 verschiedene nanostrukturierte MgO-Schichten auf den Oberflächen von Mg-Substraten durch Anodisierung und elektrophoretische Abscheidung (EPD) her. Nach einer gewissen Exposition gegenüber der nanostrukturierten Oberfläche in vitro war das Wachstum von S. aureus im Vergleich zu unbehandeltem Mg deutlich reduziert. Dies deutete auf eine größere Wirksamkeit der nanostrukturierten Oberfläche gegen bakterielle Adhäsion gegenüber der unbehandelten metallischen Mg-Oberfläche hin. Um die unterschiedlichen Mechanismen der antibakteriellen Eigenschaften verschiedener nanostrukturierter Oberflächen aufzudecken, wird in diesem Artikel eine fokussierte Kontakt-Expositionsmethode (Methode D) diskutiert, die die Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen innerhalb des interessierenden Bereichs bestimmt.

Das Ziel dieses Artikels ist es, vier In-vitro-Methoden vorzustellen, die auf verschiedene Nanopartikel, nanostrukturierte Oberflächen und mikrobielle Spezies anwendbar sind. Wir diskutieren die wichtigsten Überlegungen für jede Methode, um konsistente, reproduzierbare Daten für die Vergleichbarkeit zu erzeugen. Insbesondere werden die direkte Co-Kultur-Methode¹⁷ und die direkte Expositionsmethode verwendet, um die antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln zu untersuchen. Durch die direkte Kokulturmethode können die minimalen inhibitorischen und minimalen bakteriziden Konzentrationen (MHK bzw. MBC_90-99,99) für einzelne Spezies und die stärkste Konzentration (MPC) für mehrere Spezies bestimmt werden. Durch die Direktbelichtungsmethode können die bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkungen von Nanopartikeln bei minimalen Hemmkonzentrationen durch optische Dichtemessungen in Echtzeit über die Zeit charakterisiert werden. Die Direktkulturmethode¹⁴ eignet sich zur direkten und indirekten Untersuchung von Bakterien, die mit nanostrukturierten Oberflächen in Kontakt kommen. Schließlich wird die Methode der fokussierten Kontaktexposition¹⁶ vorgestellt, um die antibakterielle Aktivität eines bestimmten Bereichs auf einer nanostrukturierten Oberfläche durch die direkte Anwendung von Bakterien und die Charakterisierung des Bakterienwachstums an der Zell-Nanostruktur-Grenzfläche zu untersuchen. Diese Methode basiert auf der japanischen Industrienorm JIS Z 2801:2000¹⁶ und soll sich auf die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Oberfläche konzentrieren und die Auswirkungen des Abbaus von Massenproben in mikrobieller Kultur auf antimikrobielle Aktivitäten ausschließen.

Protocol

Um die direkten Kokultur- und Direktexpositionsmethoden vorzustellen, verwenden wir Magnesiumoxid-Nanopartikel (nMgO) als Modellmaterial, um bakterielle Interaktionen zu demonstrieren. Um die Methoden der direkten Kultur und des fokussierten Kontakts zu präsentieren, verwenden wir eine Mg-Legierung mit nanostrukturierten Oberflächen als Beispiele. 1. Sterilisation von Nanomaterialien HINWEIS: Alle Nanomaterialien müssen vor der mikrobiellen Kultur …

Representative Results

Die Identifizierung der antibakteriellen Aktivität von Magnesiumoxid-Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen wurde anhand von vier In-vitro-Methoden vorgestellt, die auf verschiedene Materialtypen und mikrobielle Spezies anwendbar sind. Methode A und Methode B untersuchen bakterielle Aktivitäten, wenn sie Nanopartikeln in einer Verzögerungsphase (Methode A) und einer logarithmischen Phase (Methode B) für einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger ausgesetzt werden. Metho…

Discussion

Wir haben vier in vitro Methoden (A-D) vorgestellt, um die antibakteriellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu charakterisieren. Während jede dieser Methoden das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Bakterien im Laufe der Zeit als Reaktion auf Nanomaterialien quantifiziert, gibt es einige Unterschiede bei den Methoden, die zur Messung der anfänglichen bakteriellen Aussaatdichte, des Wachstums und der Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit verwendet werden. Drei dieser Methoden, …

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2