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Bioengineering

इन विट्रो में नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

हम इन विट्रो तकनीकों का उपयोग करके नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए चार तरीकों का परिचय देते हैं। इन विधियों को माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ विभिन्न नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों, जैसे चांदी, जस्ता ऑक्साइड, टाइटेनियम डाइऑक्साइड और मैग्नीशियम ऑक्साइड की रोगाणुरोधी गतिविधियों को पहले नैदानिक और पर्यावरणीय सेटिंग्स और उपभोग्य खाद्य उत्पादों में खोजा गया है। हालांकि, प्रयोगात्मक तरीकों और उपयोग की जाने वाली सामग्रियों में स्थिरता की कमी ने परस्पर विरोधी परिणामों में परिणत किया है, यहां तक कि एक ही नैनोस्ट्रक्चर प्रकार और जीवाणु प्रजातियों के अध्ययन के बीच भी। शोधकर्ताओं के लिए जो उत्पाद डिजाइन में एक योजक या कोटिंग के रूप में नैनोस्ट्रक्चर को नियोजित करना चाहते हैं, ये परस्पर विरोधी डेटा नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग को सीमित करते हैं।

इस दुविधा का सामना करने के लिए, इस लेख में, हम नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए चार अलग-अलग तरीके प्रस्तुत करते हैं, और विभिन्न परिदृश्यों में उनकी प्रयोज्यता पर चर्चा करते हैं। सुसंगत तरीकों को अपनाने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा की उम्मीद है जिसे अध्ययनों में तुलना की जा सकती है और विभिन्न नैनोस्ट्रक्चर प्रकारों और माइक्रोबियल प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है। हम नैनोकणों की रोगाणुरोधी गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए दो तरीकों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों के लिए दो तरीकों का परिचय देते हैं।

नैनोकणों के लिए, नैनोकणों के न्यूनतम निरोधात्मक और न्यूनतम जीवाणुनाशक सांद्रता को निर्धारित करने के लिए प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि का उपयोग किया जा सकता है, और प्रत्यक्ष एक्सपोजर कल्चर विधि का उपयोग नैनोपार्टिकल एक्सपोजर से उत्पन्न वास्तविक समय बैक्टीरियोस्टेटिक बनाम जीवाणुनाशक गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के लिए, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से और सीधे नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के संपर्क में बैक्टीरिया की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जाता है, और केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि का उपयोग नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह के एक विशिष्ट क्षेत्र पर रोगाणुरोधी गतिविधि की जांच करने के लिए किया जाता है। हम नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के रोगाणुरोधी गुणों का निर्धारण करते समय इन विट्रो अध्ययन डिजाइन के लिए विचार करने के लिए प्रमुख प्रयोगात्मक चर पर चर्चा करते हैं। ये सभी विधियां अपेक्षाकृत कम लागत वाली हैं, ऐसी तकनीकों को नियोजित करती हैं जो मास्टर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हैं और स्थिरता के लिए दोहराने योग्य हैं, और नैनोस्ट्रक्चर प्रकारों और माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती हैं।

Introduction

अकेले अमेरिका में, 1.7 मिलियन व्यक्ति सालाना अस्पताल-अधिग्रहित संक्रमण (एचएआई) विकसित करते हैं, इनमें से प्रत्येक 17 संक्रमणों में से एक के परिणामस्वरूप मृत्युहो जाती है। इसके अलावा, यह अनुमान लगाया गया है कि एचएआई के लिए उपचार लागत $ 28 बिलियन से $ 45 बिलियन सालाना 1,2 तक है। ये एचएआई मेथिसिलिन प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एमआरएसए) 3,4 और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा4 द्वारा प्रबल हैं, जो आमतौर पर पुराने घाव संक्रमण से अलग होते हैं और आमतौर पर एक अनुकूल रोगी परिणाम उत्पन्न करने के लिए व्यापक उपचार और समय की आवश्यकता होती है।

पिछले कई दशकों में, इन और अन्य रोगजनक बैक्टीरिया से संबंधित संक्रमणों के इलाज के लिए कई एंटीबायोटिक वर्ग विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, रिफैमाइसिन एनालॉग का उपयोग एमआरएसए, अन्य ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक संक्रमण, और माइकोबैक्टीरियम एसपीपी संक्रमण5 के इलाज के लिए किया गया है। 1990 के दशक में, एम तपेदिक संक्रमणों की बढ़ती संख्या का प्रभावी ढंग से इलाज करने के लिए, उनकी प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए अतिरिक्त दवाओं को रिफैमाइसिन एनालॉग के साथ जोड़ा गया था। हालांकि, लगभग 5% एम तपेदिक के मामलेरिफैम्पिसिन5,6 के प्रतिरोधी रहते हैं, और बहु-दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया7 के बारे में चिंता बढ़ रही है। वर्तमान में, अकेले एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग एचएआई के उपचार में पर्याप्त नहीं हो सकता है, और इसने वैकल्पिक रोगाणुरोधी उपचारों के लिए चल रही खोज को उकसायाहै।

भारी धातुओं, जैसे चांदी (एजी) 8,9,10 और सोना (एयू) 11, और सिरेमिक, जैसे टाइटेनियम डाइऑक्साइड (टीआईओ 2)12 और जिंक ऑक्साइड (जेडएनओ)13, नैनोपार्टिकल (एनपी) रूप में (एजीएनपी, एयूएनपी, टीआईओ 2 एनपी, और जेडएनओएनपी, क्रमशः) उनकी रोगाणुरोधी गतिविधियों के लिए जांच की गई है और संभावित एंटीबायोटिक विकल्पों के रूप में पहचान की गई है। इसके अलावा, मैग्नीशियम मिश्र धातु (मिलीग्राम मिश्र धातु) 14,15,16, मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोकणों 17,18,19,20,21, और मैग्नीशियम हाइड्रॉक्साइड नैनोकणों [एनएमजीओ और एनएमजी (ओएच)2, क्रमशः] 22,23,24 जैसे जैव-पुनरुत्पादक सामग्री।इसकी भी जांच की गई है। हालांकि, नैनोकणों के पिछले रोगाणुरोधी अध्ययनों ने असंगत सामग्री और अनुसंधान विधियों का उपयोग किया, जिसके परिणामस्वरूप डेटा की तुलना करना मुश्किल या असंभव है और कभी-कभीप्रकृति में विरोधाभासी होते हैं। उदाहरण के लिए, चांदी के नैनोकणों की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) और न्यूनतम जीवाणुनाशक एकाग्रता (एमबीसी) विभिन्न अध्ययनों में काफी भिन्न होती है। आईपीई एट अल .25 ने ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ एमआईसी निर्धारित करने के लिए ~ 26 एनएम के औसत कण आकार के साथ एजीएनपी की जीवाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन किया। पी. एरुगिनोसा, ई. कोलाई, एस. ऑरियस और एमआरएसए के लिए पहचाने गए एमआईसी क्रमशः 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL और 10 μg/mL थे। इसके विपरीत, परवेकर एट अल .26 ने 5 एनएम के औसत कण आकार के साथ एजीएनपी का मूल्यांकन किया। इस उदाहरण में, एजीएनपी एमआईसी और 0.625 मिलीग्राम / एमएल का एमबीसी एस ऑरियस के खिलाफ प्रभावी पाया गया। इसके अलावा, लू एट अल .27 ने 4.06 एनएम के आकार के साथ एजीएनपी का मूल्यांकन किया। जब ई कोलाई इन नैनोकणों के संपर्क में था, तो एमआईसी और एमबीसी को 7.8 μg / mL पर रिपोर्ट किया गया था। अंत में, अली एट अल .28 ने 18 एनएम के औसत आकार के साथ गोलाकार एजीएनपी के जीवाणुरोधी गुणों की जांच की। जब पी. एरुगिनोसा, ई. कोलाई, और एमआरएसए को इन नैनोकणों के संपर्क में लाया गया, तो एमआईसी की पहचान क्रमशः 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL, और 36 μg/mL पर की गई, और MBC की पहचान क्रमशः 36 μg/mL, 42 μg/mL और 30 μg/mL पर की गई।

यद्यपि हाल के दशकों के दौरान नैनोकणों की जीवाणुरोधी गतिविधि का बड़े पैमाने पर अध्ययन और रिपोर्ट किया गया है, लेकिन अध्ययनों में प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देने के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और अनुसंधान विधियों के लिए कोई मानक नहीं है। इस कारण से, हम सामग्री और विधियों को सुसंगत रखते हुए नैनोकणों की रोगाणुरोधी गतिविधियों को चिह्नित करने और तुलना करने के लिए दो विधियों, प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि (विधि ए), और प्रत्यक्ष जोखिम विधि (विधि बी) को प्रस्तुत करते हैं।

नैनोकणों के अलावा, जीवाणुरोधी गतिविधियों के लिए नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की भी जांच की गई है। इनमें ग्रेफीन नैनोशीट्स, कार्बन नैनोट्यूब और ग्रेफाइट29 के साथ-साथ प्योर एमजी और एमजी मिश्र धातु जैसी कार्बन आधारित सामग्री शामिल हैं। इन सामग्रियों में से प्रत्येक ने कम से कम एक जीवाणुरोधी तंत्र का प्रदर्शन किया है, जिसमें कार्बन-आधारित सामग्रियों द्वारा कोशिका झिल्ली पर लगाए गए शारीरिक नुकसान और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की रिहाई के माध्यम से चयापचय प्रक्रियाओं या डीएनए को नुकसान शामिल है। इसके अलावा, जब जिंक (जेडएन) और कैल्शियम (सीए) को एमजी मिश्र धातुओं के निर्माण में जोड़ा जाता है, तो एमजी मैट्रिक्स अनाज के आकार का शोधन बढ़ाया जाता है, जिससे एमजी-केवल नमूने14 की तुलना में सब्सट्रेट सतहों पर बैक्टीरिया के आसंजन में कमी आती है। जीवाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन करने के लिए, हम प्रत्यक्ष संस्कृति विधि (विधि सी) प्रस्तुत करते हैं, जो प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सतह संपर्क के साथ बैक्टीरिया कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की मात्रा का ठहराव के माध्यम से समय के साथ नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्रियों पर और उसके आसपास बैक्टीरिया आसंजन निर्धारित करता है।

आकार, आकार और अभिविन्यास सहित सतहों पर नैनोस्ट्रक्चर की ज्यामिति, सामग्री की जीवाणुनाशक गतिविधियों को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, लिन एट अल.16 ने एनोडाइजेशन और इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव (ईपीडी) के माध्यम से एमजी सब्सट्रेट्स की सतहों पर विभिन्न नैनोस्ट्रक्चर्ड एमजीओ परतों का निर्माण किया। विट्रो में नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह के संपर्क में आने की अवधि के बाद, गैर-उपचारित एमजी की तुलना में एस ऑरियस की वृद्धि काफी कम हो गई थी। इसने बैक्टीरिया के आसंजन बनाम गैर-उपचारित धातु एमजी सतह के खिलाफ नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह की अधिक शक्ति का संकेत दिया। विभिन्न नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के जीवाणुरोधी गुणों के विभिन्न तंत्रों को प्रकट करने के लिए, एक केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि (विधि डी) जो रुचि के क्षेत्र के भीतर सेल-सतह इंटरैक्शन को निर्धारित करती है, इस लेख में चर्चा की गई है।

इस लेख का उद्देश्य चार इन विट्रो विधियों को प्रस्तुत करना है जो विभिन्न नैनोकणों, नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों और माइक्रोबियल प्रजातियों पर लागू होते हैं। हम तुलनात्मकता के लिए सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक विधि के लिए महत्वपूर्ण विचारों पर चर्चा करते हैं। विशेष रूप से, नैनोकणों के रोगाणुरोधी गुणों की जांच के लिए प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि17 और प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि का उपयोग किया जाता है। प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि के माध्यम से, न्यूनतम निरोधात्मक और न्यूनतम जीवाणुनाशक सांद्रता (एमआईसी और एमबीसी90-99.99, क्रमशः) व्यक्तिगत प्रजातियों के लिए निर्धारित की जा सकती है, और कई प्रजातियों के लिए सबसे शक्तिशाली एकाग्रता (एमपीसी) निर्धारित की जा सकती है। प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि के माध्यम से, न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता पर नैनोकणों के बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक प्रभाव को समय के साथ वास्तविक समय ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग द्वारा चित्रित किया जा सकता है। प्रत्यक्ष संस्कृति14 विधि नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के संपर्क में सीधे और अप्रत्यक्ष रूप से बैक्टीरिया की जांच के लिए उपयुक्त है। अंत में, फोकस्ड-कॉन्टैक्ट एक्सपोज़र16 विधि बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष अनुप्रयोग और सेल-नैनोस्ट्रक्चर इंटरफ़ेस पर बैक्टीरिया के विकास के लक्षण वर्णन के माध्यम से एक नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह पर एक विशिष्ट क्षेत्र की जीवाणुरोधी गतिविधि की जांच करने के लिए प्रस्तुत की जाती है। यह विधि जापानी औद्योगिक मानक जेआईएस जेड 2801: 200016 से संशोधित है, और इसका उद्देश्य माइक्रोब-सतह इंटरैक्शन पर ध्यान केंद्रित करना और रोगाणुरोधी गतिविधियों पर माइक्रोबियल संस्कृति में थोक नमूना गिरावट के प्रभावों को बाहर करना है।

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Protocol

प्रत्यक्ष सह-संस्कृति और प्रत्यक्ष जोखिम विधियों को प्रस्तुत करने के लिए, हम बैक्टीरिया की बातचीत को प्रदर्शित करने के लिए एक मॉडल सामग्री के रूप में मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोकणों (एनएमजीओ) का उपयोग करते हैं। प्रत्यक्ष संस्कृति और केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधियों को प्रस्तुत करने के लिए, हम उदाहरण के रूप में नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के साथ एक एमजी मिश्र धातु का उपयोग करते हैं।

1. नैनोमटेरियल्स की नसबंदी

नोट: माइक्रोबियल कल्चर से पहले सभी नैनोमटेरियल्स को निष्फल या कीटाणुरहित किया जाना चाहिए। जिन तरीकों का उपयोग किया जा सकता है उनमें गर्मी, दबाव, विकिरण और कीटाणुनाशक शामिल हैं, लेकिन इन विट्रो प्रयोगों से पहले प्रत्येक विधि के लिए सामग्री की सहनशीलता की पहचान की जानी चाहिए।

  1. नैनोपार्टिकल्स
    नोट: नमूने को इथेनॉल जैसे कार्बनिक विलायक में संग्रहीत किया जा सकता है या उचित तरीके से नसबंदी या कीटाणुशोधन के बाद एक डिश या बॉक्स में पैक किया जा सकता है। नैनोकणों को प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि17 और प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि के प्रदर्शन के लिए निम्नलिखित विधि का उपयोग करके निष्फल किया गया था।
    1. प्रत्येक इन विट्रो प्रयोग से पहले 60 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस संवहन ओवन30 में एमजीओ नैनोकणों को स्टरलाइज़ करें।
      नोट: इस विधि को चुना गया था क्योंकि पानी की भाप और यूवी प्रकाश एमजीओ नैनोकणों (एनएमजीओ) 17 की संरचनाओं को प्रभावित कर सकते हैं।
  2. थोक सामग्री
    नोट: प्रत्यक्ष संस्कृति विधि के प्रदर्शन के लिए निम्नलिखित विधि द्वारा नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्रियों को निष्फल किया गया था।
    1. प्रत्यक्ष संस्कृति विधि 14 के लिए, इन विट्रो अध्ययनों को शुरू करने से पहले 4 घंटे के लिए पराबैंगनी (यूवी) विकिरण का उपयोग करके तैयार जेडसी 21, एमजी और टी64 नमूनों को कीटाणुरहित करें।
    2. केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि16 के लिए, इन विट्रो अध्ययनों की शुरुआत से पहले 2 घंटे के लिए यूवी विकिरण का उपयोग करके सभी नमूनों को कीटाणुरहित करें।
  3. वैकल्पिक रूप से, गर्मी-संवेदनशील सामग्री की नसबंदी के लिए एथिलीन ऑक्साइड (ईटीओ) का उपयोग करें।

2. प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि (विधि ए)

नोट: विधि ए में, एक अंतराल-चरण सीडिंग संस्कृति में बैक्टीरिया को सीधे कुछ सांद्रता के नैनोकणों के साथ मिलाया जाता है। नैनोपार्टिकल रोगाणुरोधी गतिविधियों की जांच के लिए, हम गुयेन एट अल .17 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हैं।

  1. नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर का लक्षण वर्णन
    नोट: नैनोस्ट्रक्चर संरचना और आकार की पुष्टि एक्स-रे पाउडर विवर्तन का उपयोग करके की जाती है।
    1. नैनोकणों का मापन
      1. नैनोकणों को तीन प्रतियों में 3 एमएल नमूनों को समायोजित करने के लिए वांछित द्रव्यमान प्रति एमएल 9 गुना पर तौलें। उदाहरण के लिए, 1.8 मिलीग्राम / एमएल पर 0.2 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ वजन करें।
        नोट: यह जीवाणु संस्कृतियों और शोरबा में नैनोकणों के लगातार वितरण को सुनिश्चित करता है।
      2. सभी नैनोकणों को 5.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मापें जिसे विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके पूर्व-तौला और टारकिया गया है।
  2. बैक्टीरिया संस्कृतियों को तैयार करना और बढ़ाना
    1. प्रत्येक इन विट्रो प्रयोग के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से बैक्टीरिया सेल स्टॉक प्राप्त करें। प्रत्येक बैक्टीरिया सेल स्टॉक के 10 μL को एक उपयुक्त विकास माध्यम के 5 मिलीलीटर में जोड़ें।
    2. टीका लगाए गए माध्यम को रात भर लगभग 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेटर-शेकर में रखें।
      1. यदि स्टेफिलोकोकस प्रजातियां उगाई जाती हैं, तो उपसंस्कृति प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 400 μL को 20 mL ताजा विकास माध्यम (100 μL / 5 mL मध्यम) में रखकर और अतिरिक्त 4-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर झटकों के साथ इनक्यूबेट करती है।
  3. सीडिंग घनत्व निर्धारित करने के लिए बैक्टीरिया कोशिकाओं को धोना और गिनना।
    नोट: मूत्र पथ के संक्रमण की पुष्टि करने के लिए आवश्यक सेल संख्या से अधिक सेल संख्या के रूप में 7.8 × 106 सीएफयू / एमएल के वांछित सीडिंग घनत्व की पहचान की गई थी।
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रात भर बैक्टीरिया कल्चर के 1 एमएल को एलिकोट करके सुसंस्कृत बैक्टीरिया एकत्र करें। रात भर बैक्टीरिया संस्कृतियों से पर्याप्त संख्या में एलिकोट बनाएं और वांछित सीडिंग घनत्व तक पहुंचने के लिए उन्हें 1,956 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पेलेट कोशिकाओं से सुपरनैटेंट को हटाने के लिए पाइप करें और सुपरनैटेंट को एक संग्रह रिसेप्टेक में रखें। ताजा विकास माध्यम के 0.5 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। दो 0.5 एमएल सस्पेंशन को मिलाकर 1 एमएल सस्पेंशन बनाएं ताकि रिसस्पेंडेड कोशिकाओं के 1 एमएल एलिकोट की संख्या को छह तक कम किया जा सके। 1,956 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
    3. चरण 2.3.2 के रूप में ताजा विकास माध्यम का उपयोग करके एक दूसरा धोने का चक्र पूरा करें, ताकि पुन: निलंबित धुली हुई कोशिकाओं के 1 एमएल एलिकोट की संख्या को तीन तक कम किया जा सके।
    4. तीसरे चक्र को पूरा करें, जैसा कि चरण 2.3.2 में है, ट्रिस बफर (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) एमिनोमेथेन बफर (ट्रिस बफर, पीएच 8.5) के 0.33 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करने के अलावा। 0.33 एमएल वॉल्यूम के तीन सस्पेंशन को एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में मिलाएं। 1,956 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
      नोट: ट्रिस बफर में Mg 2+ या Ca2+ आयन31 नहीं है। यह पोस्ट-कल्चर शोरबा में एमजी 2 + और सीए2 + आयनों को मापने के लिए प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा-ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-ओईएस) के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है। इसके विपरीत, फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) 32 में मौजूद फॉस्फेट, उदाहरण के लिए, एमजी 2 + या सीए2 + आयनों 33,34,35 दोनों को अनुक्रमित करते हैं और आईसीपी-ओईएस डेटा की व्याख्या में भ्रम पैदा करते हैं।
    5. छर्रों वाली कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। सेल गोली को ताजा ट्रिस बफर के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें, जिसे सेल सस्पेंशन के रूप में जाना जाता है- एक लैग-फेज बैक्टीरियल सीडिंग कल्चर।
    6. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल निलंबन एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल) का निर्धारण करें।
  4. सीडिंग बैक्टीरिया कल्चर का निर्माण
    नोट: नमूने की कुल मात्रा 3 एमएल है और इसे तीन प्रतियों (कुल 9 एमएल) में पूरा किया जाता है।
    1. आवश्यक बैक्टीरिया सीडिंग कल्चर की कुल मात्रा निर्धारित करें। सीडिंग कल्चर बनाने के लिए,7.8× 106 सेल/एमएल की सीडिंग कल्चर बनाने के लिए आवश्यक सेल सस्पेंशन की मात्रा की गणना करने के लिए सी 1 वी 1 = सी2 वी 2का उपयोग करें। सेल निलंबन (वी1) की गणना की गई मात्रा को विकास मीडिया (वी2) की आवश्यक मात्रा में जोड़ें।
    2. सीएफयू/एमएल में वास्तविक बैक्टीरिया सीडिंग घनत्व निर्धारित करें। 10-4 तक दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने का निर्माण करें। 10-4 तनुकरण को उपयुक्त विकास आगर पर फैलाएं और रात भर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, कॉलोनियों की संख्या की गणना करें, और सीएफयू / एमएल की गणना करें।
  5. बैक्टीरिया और नैनोपार्टिकल संस्कृतियों का गठन।
    1. 12-अच्छी तरह से, गैर-ऊतक उपचारित पॉलीस्टाइनिन प्लेटों में, आवश्यक कुओं की संख्या के लिए प्रत्येक कुएं में बैक्टीरियल सीडिंग कल्चर का 2 एमएल एलिकोट किया जाता है।
    2. प्रत्येक 5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए जिसमें पहले से वजन किया गया एनएमजीओ होता है, बैक्टीरिया सीडिंग कल्चर का 3 एमएल जोड़ें। बैक्टीरिया के साथ एनएमजीओ को मिश्रित करने के लिए भंवर। एनएमजीओ के प्रत्येक पूर्व-मापा वजन के तीन प्रतियों के नमूने बनाने के लिए मिश्रण के 1 मिलीलीटर को तीन अलग-अलग कुओं में विभाजित करें। nMgO मिश्रण को प्रत्येक 1 mL एलिकोट से पहले 2-3x पिपेट करें ताकि nMgO को निलंबन में बनाए रखा जा सके।
      नोट: नियंत्रण नमूने में केवल 3 एमएल कोशिकाएं, केवल 3 एमएल मीडिया और 3 एमएल में नैनोकणों की सबसे कम और उच्चतम सांद्रता होगी। इन्हें चरण 2.5.2 के रूप में तैयार किया गया है। सभी नियंत्रण नमूने तीन प्रतियों में पूरे किए जाते हैं।
    3. सभी 12-वेल प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 120 आरपीएम पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. एनएमजीओ के संपर्क में आने के बाद जीवाणु कोशिका वृद्धि का निर्धारण
    1. बैक्टीरिया संस्कृतियों के रात भर इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक 3 एमएल नमूना एक व्यक्तिगत 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पाइप करके एकत्र करें।
    2. 1: 10 सीरियल कमजोर पड़ने के लिए 96-वेल प्लेट का उपयोग करें। बैक्टीरिया युक्त सभी नमूनों को क्रमबद्ध रूप से पतला करने के लिए आवश्यक स्तंभों की संख्या निर्धारित करें। कॉलम की उचित संख्या के लिए पंक्ति B में पंक्ति G में प्रत्येक कुएं में ट्रिस बफर के 180 μL जोड़ें।
    3. संक्षेप में प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बैक्टीरिया के नमूने होते हैं, और पंक्ति ए में एक व्यक्ति के कुएं में 50 μL जोड़ें।
    4. पंक्ति A के प्रत्येक कुएं के लिए, 20 μL को पंक्ति B (उदाहरण के लिए, A1 से B1) में स्थानांतरित करें, और 200 μL की मात्रा प्राप्त करने के लिए संक्षेप में पाइपिंग द्वारा मिलाएं। बाँझ पाइप टिप का उपयोग करके, पंक्ति B में कुएं से 20 μL को पंक्ति C में कुएं में स्थानांतरित करें। इस पैटर्न को तब तक जारी रखें जब तक कि पंक्ति G के कुएं में 200 μL न हो। पंक्ति B में 10−1 से पंक्ति G में 10−6 तक एक क्रमिक तनुकरण को पूरा करना।
    5. प्रत्येक कुएं के 100 μL को एक उपयुक्त विकास आगर प्लेट पर रखें और सेल कल्चर को फैलाने के लिए प्लेट में फैल जाएं। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटर-शेकर में रखें। प्लेटों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. प्लेटों की जांच करें और उन लोगों की गिनती करें जिनमें लगभग 25-300 कॉलोनियां हैं। यदि संभव हो, तो एक ही कमजोर पड़ने वाले मूल्य की प्लेटें चुनें। सीएफयू / एमएल की गणना करने के लिए प्रति प्लेट कॉलोनियों की संख्या का उपयोग करें।
  7. इनक्यूबेशन के बाद के पीएच का मूल्यांकन
    नोट: प्रत्येक पीएच मीटर मॉडल के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    1. पीएच 4, पीएच 7 और पीएच 10 के मानकीकरण समाधानों का उपयोग करके पीएच मीटर को पूर्व-कैलिब्रेट करें। पीएच जांच को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखकर प्रत्येक जीवाणु के नमूने को पढ़ें।
  8. आईसीपी-ओईएस के लिए नमूने तैयार करना
    नोट: आईसीपी-ओईएस का उपयोग एमजी2 + और सीए2 + आयनों की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इन पिंजरों को महत्वपूर्ण माना जाता है, क्योंकि प्रत्येक सेलुलर चयापचय में भाग लेता है।
    1. सेलुलर और नैनोपार्टिकल मलबे को पेलेट करने के लिए 5,724 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए चरण 2.6.1 में तैयार प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करके, सतह पर तैरनेवाले के 30 μL को 18.2 Ω फ़िल्टर किए गए पानी के 2.97 मिलीलीटर में पतला करें ताकि 1: 100 कमजोर पड़ने का निर्माण किया जा सके।
      नोट: कमजोर पड़ने वाले कारक को अनुमानित आयन सांद्रता और स्पेक्ट्रोमीटर उपकरण की पहचान सीमा के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
    3. आईसीपी-ओईएस का उपयोग करके नमूने पढ़ें।

3. प्रत्यक्ष प्रदर्शन विधि (विधि बी)

नोट: यदि चुने हुए बैक्टीरिया की वृद्धि दर अज्ञात है, तो इस विधि को लागू करने से पहले विकास वक्र का मानकीकरण पूरा किया जाना चाहिए।

  1. रुचि के नैनोकणों के संपर्क में आने पर वास्तविक समय बैक्टीरियोस्टेटिक और जीवाणुनाशक गतिविधियों का निर्धारण करें।
    1. चरण 2.1-2.1.2.2 में वर्णित विधियों का उपयोग करके नैनोकणों की वांछित सांद्रता तैयार करें। उपयोग किए जाने वाले नैनोकणों के प्रत्येक वजन के दो सेट तैयार करें: एक को लघुगणकीय विकास चरण में बैक्टीरिया संस्कृति के 3 एमएल एलिकोट में जोड़ा जाना है, और दूसरे को नियंत्रण समूहों के रूप में बैक्टीरिया के बिना विकास माध्यम के 3 एमएल एलिकोट में जोड़ा जाना है।
    2. परीक्षण किए जाने वाले बैक्टीरिया प्रजातियों के लिए उपयुक्त बैक्टीरियोस्टेटिक और जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं का निर्धारण करें।
      नोट: प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता का ज्ञान आवश्यक है।
  2. सभी नैनोपार्टिकल, एंटीबायोटिक और नियंत्रण नमूनों के लिए तीन प्रतियों 3 एमएल नमूनों के लिए आवश्यक जीवाणु संस्कृति की कुल मात्रा की गणना करें।
    नोट: बाँझ विकास माध्यम की एक समान मात्रा की आवश्यकता है। यदि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के उपयोग की योजना बनाई गई है, तो इसके लिए क्यूवेट के लिए आवश्यक 0.5 एमएल से 1.0 एमएल वॉल्यूम के आवास के लिए आवश्यक कुल मात्रा में समायोजन करने की आवश्यकता होती है।
  3. दिन 1: प्रत्येक इन विट्रो प्रयोग के लिए, चरण 2.2.1-2.2.2 का पालन करते हुए रात भर के स्टॉक बनाएं।
  4. दिन 2: पुष्टि करें कि प्लेट रीडर सेटिंग्स 600 एनएम के ऑप्टिकल घनत्व के साथ 96-वेल प्लेट को समायोजित कर सकती हैं। 96-वेल प्लेट का उपयोग करके 200 μL एलिकोट में नमूने को मापें।
    1. 0.01 पर एक प्रारंभिक जीवाणु संस्कृति ओडी600 निर्धारित करें- नैनोकणों और एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने से पहले प्रारंभिक इनक्यूबेशन अवधि शुरू करने के लिए उपयोग किया जाने वाला घनत्व।
    2. इनक्यूबेटर-शेकर से रातोंरात बैक्टीरिया कल्चर इकट्ठा करें।
      1. प्रत्येक सामग्री (जैसे, पूर्व-मापा नैनोकणों या एंटीबायोटिकदवाओं) का परीक्षण करने के लिए, 0.01 के ओडी600 पर एक अलग जीवाणु संस्कृति बनाएं। आवश्यक सेल कल्चर की मात्रा को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़े कंटेनर का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, एक निष्फल एर्लेनमेयर फ्लास्क या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब)।
      2. विकास माध्यम के तीन 200 μL एलिकोट को तीन कुओं में और बैक्टीरिया कल्चर के तीन 200 μL एलिकोट को अतिरिक्त कुओं (जैसे, A1 से A6) में रखकर विकास माध्यम के साथ रातोंरात बैक्टीरिया के नमूनों को पतला करें।
      3. 96-वेल प्लेट को प्लेट रीडर में रखें और इसे स्कैन करें।
        नोट: औसत मूल्य उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक स्कैन किए गए के लिए रीडिंग का औसत निकाला जाता है।
      4. निलंबन में बैक्टीरिया के घनत्व की गणना करने के लिए, तीन प्रतियों के नमूने वाले प्रत्येक कुएं के लिए औसत मूल्य का औसत करें।
      5. बैक्टीरिया के ऑप्टिकल घनत्व को निर्धारित करने के लिए, बैक्टीरिया के औसत से शोरबा नमूना औसत घटाएं।
      6. यदि बैक्टीरियल निलंबन को समायोजित करना जारी रखना आवश्यक है, तो आवश्यकतानुसार शोरबा या रात भर बैक्टीरियल कल्चर जोड़ना जारी रखें, और प्लेट रीडर में स्कैनिंग को आवश्यकतानुसार दोहराएं जब तक कि लगभग 0.01 का ओडी600 तक न पहुंच जाए।
      7. लघुगणकीय वृद्धि तक पहुंचने तक 150 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेटर शेकर से बैक्टीरिया संस्कृतियों को हटा दें।
    1. ओडी600 0.01 बैक्टीरियल कल्चर के एलिकोट 3 एमएल को तीन प्रतियों में परीक्षण और नियंत्रण नमूनों के परीक्षण और नियंत्रण के लिए लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में लेबल किया जाता है।
    2. 96-वेल प्लेट के तीन कुओं में बैक्टीरियल कल्चर के एलिकोट 200 μL और प्लेट रीडर का उपयोग करके नमूने को मापें।
    3. चरण 3.4.2.2 और चरण 3.4.2.6-"-0.5 घंटे पढ़ने" में पहले वर्णित रीडिंग की गणना करें।
  6. बैक्टीरिया/नैनोपार्टिकल मिश्रण का निर्माण और माप
    1. जीवाणु संस्कृतियों के बराबर संख्या में 3 मिलीलीटर बाँझ विकास माध्यम को नियंत्रण नमूने (तीन प्रतियों में) के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में लेबल किया जाता है।
    2. नैनोपार्टिकल सस्पेंशन और स्टेराइल मीडिया/नैनोपार्टिकल सस्पेंशन तैयार करने के लिए, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के प्रत्येक तीन प्रतियों के सेट से 1 एमएल बैक्टीरियल कल्चर या माध्यम को हटा दें।
      1. 1 एमएल एलिकोट को 5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें पूर्व-मापा नैनोपार्टिकल्स होते हैं, और मिश्रण करने के लिए भंवर संक्षेप में होता है।
      2. 5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से, नैनोकणों को सजातीय रूप से वितरित करने के लिए बैक्टीरिया / नैनोपार्टिकल या मध्यम / नैनोपार्टिकल निलंबन के 1 एमएल एलिकोट को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में वापस करें।
        नोट: नैनोकणों को निलंबन में बनाए रखने के लिए प्रत्येक 1 एमएल एलिकोट को पाइप करने से पहले बैक्टीरिया / नैनोपार्टिकल मिश्रण 2x-3x को पाइप किया जाता है।
  7. जीवाणु/एंटीबायोटिक मिश्रण का निर्माण और माप
    1. जीवाणु/एंटीबायोटिक संस्कृतियों को बनाने के लिए, इनक्यूबेटेड बैक्टीरियल कल्चर के 3 एमएल को तदनुसार लेबल किए गए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में शामिल किया जाता है।
    2. सभी नमूने तैयार होने के बाद, प्रत्येक नमूने के 200 μL को 96-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में डालें।
    3. प्लेट रीडर में प्लेट (ओं) को रखें, और स्कैनिंग-"0 एच" रीडिंग शुरू करें।
    4. नमूने वाले 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर इनक्यूबेटर-शेकर में रखें। चरण 3.4.2.2 और चरण 3.4.2.6 में पहले वर्णित सभी डेटा रिकॉर्ड करें।
  8. 0 घंटे पढ़ने को पूरा करने के लगभग 15 मिनट बाद, चरण 3.7.2-3.7.3-"0.5 घंटे" रीडिंग में वर्णित चरणों को दोहराएं।
    1. स्थापित 0 घंटे के बाद, चरण 3.7.2-चरण 3.7.3 में वर्णित चरणों को छह चक्रों के लिए हर 90 मिनट में दोहराएं; 9 घंटे में पूरा हो गया।
    2. छठा चक्र पूरा होने के बाद, नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर अतिरिक्त 15 घंटे के लिए इनक्यूबेटर-शेकर में रखें। 24 घंटे पढ़ने के लिए चरण 3.7.2-3.7.3 में वर्णित चरणों को दोहराएं। चरण 3.4.2.2 और चरण 3.4.2.6 में पहले वर्णित सभी डेटा रिकॉर्ड करें।

4. प्रत्यक्ष संस्कृति विधि (विधि सी)

नोट: विधि सी में, एक अंतराल-चरण सीडिंग संस्कृति में बैक्टीरिया को सीधे रुचि की नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों पर रखा जाता है। नैनोस्ट्रक्चर रोगाणुरोधी गतिविधियों की जांच के लिए, हम झांग एट अल .14 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हैं। इस प्रत्यक्ष संस्कृति विधि को प्रदर्शित करने के लिए, जेडसी 21 (एमजी-जेडएन-सीए मिश्र धातु) और एमजी पिन का उपयोग नमूने के रूप में किया गया था।

  1. बैक्टीरिया संस्कृतियों को तैयार करना और विकसित करना
    1. प्रत्येक इन विट्रो प्रयोग के लिए, चरण 2.2.1-2.2.2 का पालन करते हुए रातोंरात स्टॉक बनाएं।
  2. सीडिंग घनत्व निर्धारित करने के लिए बैक्टीरिया को धोना और गिनना।
    नोट: 7.5 × 105 सीएफयू / एमएल के वांछित सीडिंग घनत्व को रिपोर्ट किए गए सेल एकाग्रता के रूप में पहचाना गया था जो आर्थोपेडिक संक्रमणका कारण बनता है।
    1. इनक्यूबेटर-शेकर से रातोंरात बैक्टीरिया कल्चर को पुनः प्राप्त करें।
    2. चरण 2.3.2-2.3.2.3 का पालन करते हुए बैक्टीरिया को धोएं और इकट्ठा करें, लेकिन प्रत्येक धोने के चरण के लिए संशोधित नकली शरीर द्रव (आरएसबीएफ) के साथ ताजा माध्यम को बदलें।
      नोट: आरएसबीएफ एक बफर समाधान है जो मानव रक्त प्लाज्मा की आयनिक एकाग्रता की नकल करता है। हालांकि, आरएसबीएफ में केवल अकार्बनिक यौगिक होते हैं, और प्रोटीन जैसे किसी भी बायोकार्बनिक यौगिकों के बिना होता है। इसे हल करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को आरएसबीएफ के साथ जोड़ा जाता है ताकिप्रयोगात्मक परिस्थितियों में कैल्सीफाइड ऊतकों में एपेटाइट के प्राकृतिक गठन की बेहतर नकल करने के लिए मानव रक्त की संरचना का अनुकरण किया जा सके।
    3. छर्रों वाली कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। सेल गोली को 10% एफबीएस-सेल निलंबन के साथ पूरक आरएसबीएफ के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    4. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल निलंबन एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल) का निर्धारण करें। 10% एफबीएस के साथ पूरक आरएसबीएफ में सेल निलंबन को 7.5 × 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें। चरण 2.4.1 का पालन करते हुए एक सीडिंग संस्कृति बनाएँ।
    5. चरण 2.4.2 का पालन करते हुए वास्तविक सीडिंग घनत्व निर्धारित करें।
  3. कल्चर कुओं में नमूनों पर बैक्टीरियल सेल निलंबन वितरित करें।
    1. दोनों नमूनों और नियंत्रण नमूनों को 48-अच्छी तरह से, गैर-ऊतक उपचारित पॉलीस्टाइनिन प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में रखें।
    2. नमूने और नियंत्रण वाले प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन का 0.75 एमएल एलिकोट करें। 48-वेल प्लेट (ओं) को 120 आरपीएम पर हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर-शेकर में रखें।
  4. जीवाणु एकाग्रता का लक्षण वर्णन
    1. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, नमूने एकत्र करें और उन्हें अलग, लेबल किए गए संग्रह ट्यूबों में रखें।
    2. प्रत्येक समूह से दो नमूने एकत्र करें और उन्हें व्यक्तिगत रूप से लेबल 5.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें। प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल आरएसबीएफ जोड़ें।
    3. चरण 4.4.2 में एकत्र किए गए नमूनों को सोनिकेशन स्नान में रखें, और 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें। प्रत्येक 5 मिनट की अवधि के बाद, 5 सेकंड के लिए प्रत्येक नमूने को भंवर करें।
    4. नए अलग किए गए जीवाणु कोशिकाओं वाले आरएसबीएफ को इकट्ठा करें और निलंबन को एक लेबल, ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
  5. बैक्टीरिया को क्रमिक रूप से कमजोर करना और चढ़ाना
    1. चरण 2.6.2-2.6.6 का पालन करते हुए बैक्टीरियल सस्पेंशन को क्रमबद्ध रूप से पतला और प्लेट करें।
  6. चरण 2.7 का पालन करके संस्कृति मीडिया के पोस्ट-इनक्यूबेशन पीएच का मूल्यांकन करें।
  7. चरण 2.8 में वर्णित विधियों का पालन करके आईसीपी-ओईएस के लिए पोस्ट-कल्चर माध्यम तैयार करें।

5. केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि (विधि डी)

नोट: विधि डी में, नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर पेपर पर बैक्टीरिया को नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों पर रुचि के क्षेत्र के साथ सीधे संपर्क में रखा जाता है। यह विधि जीवाणु गतिविधियों के साथ जीवाणु संस्कृतियों में थोक नमूना गिरावट के हस्तक्षेप को कम करती है। नैनोसरफेस रोगाणुरोधी गतिविधियों की जांच करने के लिए, हम लिन एट अल .16 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हैं।

  1. बैक्टीरियल सीडिंग कल्चर बनाने के लिए चरण 2.2.1-2.2.2.1 में प्रक्रियाओं का पालन करें। चरण 2.4.2 के बाद वास्तविक सीडिंग घनत्व की पुष्टि करें।
  2. एक चौकोर आकार में 1 × 1 सेमी2 के आकार के नमूने तैयार करें। तीन प्रतियों में सभी नमूना प्रकार तैयार करें। यदि आवश्यक हो, तो नमूने को एक त्रि-आयामी (3 डी) धारक पर रखें जो 15 मिमी व्यास से 10 मिमी ऊंचाई का है। नमूना और धारक को एक गैर-ऊतक संस्कृति-उपचारित पॉलीस्टाइनिन वेल प्लेट के कुएं में रखें।
  3. प्रत्येक को 1 सेमी के व्यास में ट्रिम करके निष्फल नाइट्रोसेल्यूलोज पेपर तैयार करें। तैयार नाइट्रोसेल्यूलोज पेपर को उचित माध्यम युक्त एक आगर प्लेट पर रखें।
  4. फिल्टर पेपर पर पतला बैक्टीरियल कल्चर का पाइपेट 50 μL।
  5. प्रत्येक नमूना सतह के केंद्र पर एक उपयुक्त माध्यम का पाइपेट 50 μL।
  6. निष्फल चिमटी का उपयोग करके, आगर की सतह से नाइट्रोसेल्यूलोज पेपर उठाएं। नाइट्रोसेल्यूलोज पेपर को ध्यान से पलटें और इसे नमूना सतह पर रखें ताकि बैक्टीरिया मध्यम के 50 μL और रुचि की नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह के संपर्क में हों।
  7. आर्द्रता को बनाए रखने के लिए एक नमूना वाले प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर ट्रिस बफर जोड़ें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों वाले पॉलीस्टाइनिन वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. प्रत्येक नमूना सतह से नाइट्रोसेल्यूलोज पेपर एकत्र करें। प्रत्येक को ट्रिस बफर के 5 एमएल में रखें। 5 सेकंड के लिए एकत्र किए गए फिल्टर पेपर और नैनोफेस्ड सामग्री के नमूने भंवर।
  9. प्रत्येक नमूने को 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें। 5 मिनट के बाद 5 सेकंड के लिए भंवर और फिर 10 मिनट के बाद।
  10. सभी नमूनों से ट्रिस बफर सस्पेंशन एकत्र करें और प्रत्येक मात्रा को अलग-अलग ताजा संग्रह ट्यूबों में रखें।
  11. चरण 2.6.2-2.6.6 का पालन करते हुए नमूने को क्रमबद्ध रूप से पतला और प्लेट करें।

6. बैक्टीरिया और नैनोमटेरियल्स का पोस्ट-कल्चर लक्षण वर्णन।

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके जीवाणु आसंजन और आकृति विज्ञान की परीक्षा
    1. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, 48-अच्छी तरह से, गैर-ऊतक उपचारित पॉलीस्टाइनिन प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10% ग्लूटाराल्डिहाइड जोड़ें जब तक कि नमूने पूरी तरह से कवर न हो जाएं। जीवाणु कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    2. ग्लूटाराल्डिहाइड को एक अपशिष्ट बोतल में डालें और गैर-अनुयायी बैक्टीरिया को हटाने के लिए ट्रिस बफर समाधान के साथ सभी नमूनों को 3 गुना कुल्ला करें।
    3. 30%, 75%, और 100% इथेनॉल का उपयोगकरके नमूनों को 30 मिनट के लिए निर्जलित करें।
      नोट: नमूने को सूखने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को हवा में सुखाना आदर्श नहीं है।
    4. एसईएम स्टब पर नमूने को ठीक करने के लिए प्रवाहकीय चिपकने वाले टेप, जैसे तांबा या कार्बन टेप का उपयोग करें। इमेजिंग से पहले चालकता प्रदान करने के लिए स्पटर कोटिंग के माध्यम से नमूना सतहों को कोट करें (उदाहरण के लिए, 20 एमए16 पर 45 सेकंड के लिए प्लैटिनम / पैलेडियम (पीटी / पीडी) के तहत पालन किए गए बैक्टीरिया के साथ कोट एमजी प्लेटें)।
      नोट: नमूना प्रकारों के आधार पर कोटिंग सामग्री, प्रसंस्करण समय और ऑपरेशन वर्तमान भिन्न हो सकते हैं।
    5. एक उपयुक्त कामकाजी दूरी और तेज वोल्टेज और वांछित आवर्धन पर एसईएम का उपयोग करके नमूनों पर बैक्टीरिया की छवियां लें। उदाहरण के लिए, 5 मिमी की कामकाजी दूरी और 10 केवी16 के त्वरित वोल्टेज पर छवियों को लेने के लिए एक माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ एसईएम का उपयोग करें।
  2. एसईएम का उपयोग करके पोस्ट-कल्चर नैनोमटेरियल नमूनों की सतह आकृति विज्ञान की जांच करें।
    1. नैनोमटेरियल्स के लिए, नमूने से जुड़े मुक्त बैक्टीरिया को हटाने के लिए ट्रिस बफर 3 एक्स का उपयोग करके नमूने धोएं। नैनोकणों के लिए, कणों को एक विलायक में फैलाएं जो जरूरत पड़ने पर बेहतर फैलाव प्राप्त करने के लिए अल्ट्रासोनिकेशन के माध्यम से नमूना गुणों को प्रभावित नहीं करता है।
    2. धोने की प्रक्रिया के बाद नमूने को सुखाएं।
    3. एसईएम स्टब पर नमूने का पालन करने के लिए कार्बन या तांबे के दो तरफा चिपकने वाले टेप का उपयोग करें।
    4. इमेजिंग से पहले चरण 6.1.4 में वर्णित स्पटर कोटर का उपयोग करके पीटी / पीडी की प्रवाहकीय सतह परत बनाएं। चरण 6.1.5 में वर्णित नमूना छवियों को लें।
    5. एक उपयुक्त त्वरित वोल्टेज के साथ और वांछित आवर्धन पर ईडीएस का उपयोग करके सतह मौलिक संरचना का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, एसईएम विश्लेषण 16 करने के बाद10 केवी पर)।
  3. जीवाणु आसंजन की प्रतिदीप्ति इमेजिंग
    1. पहले ट्रिस बफर 3 एक्स के साथ धोकर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नमूने को कल्पना करने के लिए तैयार करें। कमरे के तापमान पर नमूने को हवा में सुखाएं।
    2. स्थापित प्रोटोकॉल37 का पालन करते हुए प्रत्येक नमूने को 10 μM थिओफ्लेविन टी फ्लोरेसेंस डाई के साथ दाग दें।
    3. इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस डिजिटल कैमरा के साथ युग्मित एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीवाणु आसंजन की प्रतिदीप्ति इमेजिंग करें।

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Representative Results

मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की जीवाणुरोधी गतिविधि की पहचान चार इन विट्रो विधियों का उपयोग करके प्रस्तुत की गई है जो विभिन्न सामग्री प्रकारों और माइक्रोबियल प्रजातियों में लागू होते हैं।

विधि ए और विधि बी 24 घंटे या उससे अधिक की अवधि के लिए अंतराल चरण (विधि ए) और लॉग चरण (विधि बी) में नैनोकणों के संपर्क में आने पर जीवाणु गतिविधियों की जांच करते हैं। विधि ए एमआईसी और एमबीसी के बारे में परिणाम प्रदान करता है, जबकि विधि बी नैनोकणों के निरोधात्मक बनाम जीवाणुनाशक प्रभाव निर्धारित करता है। विधि सी नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के साथ प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क के साथ जीवाणु गतिविधियों की जांच करती है, और विधि डी 24 घंटे या उससे अधिक की अवधि के लिए सेल-नैनोस्ट्रक्चर इंटरफ़ेस के चुनिंदा क्षेत्र पर बैक्टीरिया की गतिविधियों की जांच करती है।

उपयोग की जाने वाली विधियों को चित्रा 1 और चित्रा 2 में वर्णित किया गया है, और उनके परिणाम चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7 और चित्रा 8 में प्रस्तुत किए गए हैं। प्रतिनिधि प्रयोगात्मक परिणाम जो ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया और खमीर के खिलाफ एनएमजीओ की रोगाणुरोधी गतिविधि को निर्धारित करते हैं, चित्र 3 में देखे जा सकते हैं। MRSA के खिलाफ nMgO और nMg (OH)2 की जीवाणुरोधी गतिविधियों को चित्र 4 में देखा जा सकता है। एमआरएसए के खिलाफ नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की जीवाणुरोधी गतिविधियों को चित्रा 5 और चित्रा 6 में देखा जा सकता है। अंत में, ई कोलाई के खिलाफ मैग्नीशियम मिश्र धातुओं की जीवाणुरोधी गतिविधि को चित्रा 8 बी में देखा जा सकता है।

विधि ए का उपयोग करके, लगातार तरीकों और सामग्रियों का उपयोग करके नैनोकणों के संपर्क में आने वाले बैक्टीरिया के लिए एमआईसी और एमबीसी निर्धारित करना संभव है। यह स्थिरता परीक्षण किए गए नैनोकणों की सबसे शक्तिशाली एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पहचाने गए एमबीसी का उपयोग करके प्रजातियों के बीच तुलना करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, इस विधि को एमआईसी और न्यूनतम घातक सांद्रता (एमएलसी17) की तुलना के लिए सूक्ष्मजीवों के अन्य वर्गीकरणों पर भी लागू किया जा सकता है। यहां, निष्फल नैनोकणों को एक मात्रा में पूर्व-मापा गया था जो आवश्यक प्रत्येक एकाग्रता की तीन प्रतियों की अनुमति देता है। इन नैनोकणों को 6 × 10 6-8 × 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के साथ एक अंतराल-चरण मोनो-बैक्टीरिया सीडिंग कल्चर में निलंबित कर दिया गया था। सीडिंग कल्चर या शोरबा के साथ पूर्व-मापा नैनोकणों को निलंबित करने के लिए वर्णित विधि ने सफलतापूर्वक तीन प्रतियों के नमूने बनाए जो नैनोपार्टिकल वितरण में अपेक्षाकृत समरूप थे, जो तीन प्रतियों के नमूनों के भीतर सीएफयू / एमएल में विचलन को कम कर सकते हैं। इस विधि के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्र 1A में चित्रित किया गया है। ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया और कैंडिडा एसपीपी पर एनएमजीओ के रोगाणुरोधी प्रभावों का प्रदर्शन। विधि ए का उपयोग चित्र 3 में देखा जा सकता है। यहां, ग्राम-नकारात्मक एस्चेरिचिया कोलाई और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए 1.0 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ के एमआईसी के साथ-साथ 1.0 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ के क्रमशः 1.0 मिलीग्राम / एमएल और 1.6 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ के एमबीसी99.99 की पहचान इन प्रजातियों के लिए की गई थी (चित्रा 3 ए)। ग्राम पॉजिटिव एस एपिडर्मिडिस, एस ऑरियस और एमआरएसए ने क्रमशः 0.5 मिलीग्राम / एमएल, 0.7 मिलीग्राम / एमएल और 1.0 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ के एमआईसी का प्रदर्शन किया। 1.6 मिलीग्राम/एमएल और 1.2 मिलीग्राम/एमएल एनएमजीओ के एमबीसी 99.99 मूल्यों की पहचान क्रमशः एस. एपिडर्मिडिस और एस. ऑरियस के लिए की गई थी, जबकि एमआरएसए को एमबीसी90 (चित्रा 3 बी) से आगे कम नहीं किया गया था। दवा-संवेदनशील और दवा प्रतिरोधी कैंडिडा एसपीपी, सी अल्बिकन्स और सी अल्बिकन्स एफआर में, क्रमशः 1.2 मिलीग्राम / एमएल और 1.0 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ के एमआईसी की पहचान की गई थी। इसके विपरीत, एनएमजीओ ने क्रमशः सी ग्लेब्राटा और सी ग्लेब्राटा ईआर के लिए 1.0 और 0.7 मिलीग्राम / एमएल के एमआईसी मूल्यों का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, प्रत्येक कैंडिडा प्रजाति 0.7-1.2 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ के एमबीसी 90 तक पहुंच गई, लेकिन केवल सी.ग्लेब्राटा ईआर को 1.2 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ (चित्रा 3 सी) पर एमबीसी 99.99 तक कम कर दिया गया था। इसके अलावा, परीक्षण की गई अधिकांश प्रजातियों में, एनएमजीओ की सबसे शक्तिशाली एकाग्रता (एमपीसी) की पहचान निर्धारित की गई थी। एमपीसी नैनोपार्टिकल एकाग्रता को इंगित करता है जो पॉली-माइक्रोबियलसमुदायों में सबसे प्रभावी है।

विधि बी लघुगणकीय विकास चरण में बैक्टीरिया को कुछ सांद्रता के नैनोकणों में उजागर करता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि नैनोकण विधि ए में पहचाने गए एमबीसी का उपयोग करके बैक्टीरियोस्टेटिक (निरोधात्मक) या जीवाणुनाशक हैं या नहीं। यह विधि नैनोपार्टिकल एक्सपोजर के जवाब में बैक्टीरिया के विकास में परिवर्तन की पहचान करने के लिए असतत समय अवधि में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (ओडी600) माप का उपयोग करती है। इसके अलावा, बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने वाले बैक्टीरिया को इन नैनोपार्टिकल गतिविधियों की पहचान में संदर्भ प्रदान करने के लिए अलग-अलग कुओं में नैनोपार्टिकल-उजागर बैक्टीरिया के साथ समवर्ती रूप से उगाया जाता है। उपयोग किए गए एनएमजीओ और एनएमजी (ओएच) 2 की सांद्रता पिछले अध्ययन से प्राप्त की गई थी, जिसमें एनएमजीओ और एनएमजी (ओएच) 2 के संपर्क में आने वाले लघुगणकीय विकास चरण के बैक्टीरिया का उपयोग किया गया था। एनएमजीओ और एनएमजी (ओएच) 2 की सांद्रता की पहचान 5 एमएम से 50 एमएम तक के एमएम समकक्षों का उपयोग करके की गई थी। परिणामों से पता चला कि एनएमजीओ 30 एमएम (1.2 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ) पर एमआरएसए के लिए जीवाणुनाशक था, जबकि एनएमजी (ओएच) 2 50 एमएम (2.9 मिलीग्राम / एमएल एनएमजी (ओएच)2) पर बैक्टीरियोस्टेटिक था। उपयोग किए गए एंटीबायोटिक दवाओं की सांद्रता साहित्य से पहचानी गई थी और हमारे अपने प्रयोगों में पुष्टि की गई थी। इस विधि के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्रा 1 बी में चित्रित किया गया है। विधि बी के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में देखा जा सकता है। यहां, नैनोकणों के संपर्क में नहीं आने वाला एमआरएसए तेजी से 0.85 के ओडी600 तक बढ़ गया। 1.2 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ और 6.25 μg / mL ट्राइमेथोप्रिम के संपर्क में आने पर, बैक्टीरिया की वृद्धि 0.18 के OD 600 (क्रमशः 80.2% और 81.6%) तक कम हो गई, और 2.9 mg / mL nMg (OH)2 ने बैक्टीरिया के विकास को 0.25 (70.3%) के OD600 तक कम कर दिया। 1.0 μl / mL वैनकोमाइसिन के संपर्क में आने से MRSA के विकास में 99.99% की कमी आई, यह सुझाव देते हुए कि यहां उपयोग किए जाने वाले nMgO और nMg (OH)2 की सांद्रता गतिविधि में बैक्टीरियोस्टेटिक थी।

विधि सी नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की जीवाणुरोधी गतिविधि की जांच करती है। अंतराल-चरण विकास में एक जीवाणु संस्कृति को सतह के साथ या बिना सीएफयू को मापने के लिए सीधे एक नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह पर बीज दिया गया था। इस विधि का उपयोग करके, सीधे संपर्क स्थितियों के तहत बैक्टीरिया के आसंजन और व्यवहार्यता पर सतह के प्रभाव को निर्धारित करना संभव था। नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के साथ सीधे संपर्क में और अप्रत्यक्ष संपर्क (कल्चर सस्पेंशन में) में बैक्टीरिया को एकत्र किया गया और प्रत्येक स्थिति के तहत बैक्टीरिया के विकास को निर्धारित करने के लिए सीएफयू / एमएल में मात्रा निर्धारित की गई। प्राप्त ये डेटा नैदानिक उपयोग के लिए सतहों पर नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्रियों के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोगी हो सकते हैं, जहां सतह संरचनाओं पर जीवाणु उपनिवेशीकरण में कमी वांछित है। इस विधि के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्रा 2 ए में चित्रित किया गया है। विधि C के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5 में देखा जा सकता है। यहां, अप्रत्यक्ष संपर्क के साथ बैक्टीरिया के विकास का कोई अवरोध नहीं था। हालांकि, बैक्टीरियल आसंजन सभी सब्सट्रेट्स के लिए कम हो गया था, सबसे महत्वपूर्ण रूप से जेडसी 21 मिश्र धातु के साथ, इसके बाद टी 64 (टाइटेनियम), मैग्नीशियम, ग्लास केवल और जेडएसआर 41 मिश्र धातु, क्रमशः। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि जेडसी 21में परीक्षण किए गए सभी नमूनों के लिए एमआरएसए के आसंजन और विकास के खिलाफ सबसे मजबूत जीवाणुरोधी गतिविधि थी।

विधि डी एक नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह पर फिल्टर पेपर में बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष प्लेसमेंट के माध्यम से सेल-नैनोस्ट्रक्चर इंटरफ़ेस में रुचि के चुनिंदा क्षेत्र में जीवाणुरोधी गतिविधि की जांच करता है। इस विधि का उपयोग करके, जीवाणुरोधी गतिविधि और सतह गुणों के बीच एक सहसंबंध, जैसे कि सतह रसायन विज्ञान, खुरदरापन, और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह का क्षेत्र,16 की पहचान की जा सकती है। इस विधि के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्रा 2 बी में चित्रित किया गया है। विधि D के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 6 में देखा जा सकता है। यहां, 1.9 ए, 1.9 एए और ईपीडी नमूनों या उनके युग्मित फिल्टर पेपर पर कोई व्यवहार्य एस ऑरियस की पहचान नहीं की गई थी। हालांकि, एनीलिंग (ए-ईपीडी) के बाद ईपीडी नमूनों के संपर्क में आने से नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह और युग्मित फिल्टर पेपर पर कुछ कोशिकाओं में बैक्टीरिया की वृद्धि कम हो गई। मैग्नीशियम (एमजी) युक्त नमूने में भी कोई जीवाणु वृद्धि नहीं थी, लेकिन व्यवहार्य बैक्टीरिया को युग्मित फिल्टर पेपर से अलग किया गया था। एस ऑरियस के विकास में कमी टाइटेनियम और ग्लास के नमूनों या उनके युग्मित फिल्टर पेपर16 के साथ नहीं देखी गई थी।

रोगाणुरोधी गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए ऊपर वर्णित विधियों के उपयोग के अलावा, एसईएम और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्रियों के संपर्क में आने के बाद सूक्ष्मजीवों में होने वाले रूपात्मक परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। पोस्ट-एक्सपोजर ग्राम-नेगेटिव एस्चेरिचिया कोलाई को दिखाने वाले प्रतिनिधि एसईएम चित्र 7 ए में प्रस्तुत किए गए हैं, और पोस्ट-एक्सपोजर ग्राम-पॉजिटिव एस ऑरियस दिखाने वाले चित्र 7 बी में प्रस्तुत किए गए हैं। 5,000x आवर्धन के साथ एसईएम इमेजिंग तकनीक का उपयोग करके, 0.5 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ या उससे अधिक की सांद्रता के संपर्क में ई कोलाई में फेनोटाइपिक परिवर्तनोंकी पहचान की जा सकती है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग सूक्ष्मजीवों में रूपात्मक परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन एसईएम की तुलना में संभावित रूप से कम लागत और अधिक पहुंच के साथ। चित्र 8 1 दिन, 2 दिन और 3 दिनों के लिए नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्री MgY_O के संपर्क में आने वाले ई कोलाई की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों को दर्शाता है, साथ ही संदर्भ ई कोलाई भी । केवल एक जीवाणु प्रजाति, ई कोलाई, शुरू में इस्तेमाल किया गया था। भविष्य में, हम MgY_O जोखिम के लिए बैक्टीरिया प्रतिक्रियाओं की अधिक व्यापक समझ पैदा करने के लिए अतिरिक्त जीवाणु प्रजातियों को रुचि की समान सामग्री को उजागर करने पर विचार करेंगे। इन परिणामों में, व्यक्तिगत ई कोलाई कोशिकाओं और कॉलोनियों कोMgY_O 15 की जीवाणुरोधी गतिविधि के गुणात्मक विश्लेषण के लिए थियोफ्लेविन टी स्टेनिंग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा और चित्रित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: नैनोपार्टिकल एमआईसी या एमबीसी90-99.99 और पोस्ट-एक्सपोजर सेल संस्कृतियों में बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए योजनाबद्ध आरेख । (ए) प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि17। (बी) प्रत्यक्ष प्रदर्शन विधि। संक्षेप: सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां; एनपी = नैनोकणों; OD 600 =600 nm पर ऑप्टिकल घनत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क के साथ बैक्टीरिया के विकास को निर्धारित करने के लिए योजनाबद्ध आरेख और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के सेल-नैनोस्ट्रक्चर इंटरफ़ेस पर। (ए) प्रत्यक्ष संस्कृति विधि14। (बी) केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि16। संक्षेप: सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां; एसईएम = स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: 0-2.0 मिलीग्राम/एमएल एनएमजीओ के संपर्क में आने के बाद सीएफयू/एमएल 24 घंटे द्वारा निर्धारित व्यवहार्य बैक्टीरिया और खमीर का प्रतिनिधित्व। (बी) ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के सीएफयू / एमएल, जिसमें एस एपिडर्मिडिस, एस ऑरियस और मेथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस शामिल हैं। (सी) दवा-अतिसंवेदनशील सी अल्बिकन्स, दवा प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स एफआर, दवा-अतिसंवेदनशील सी ग्लेब्राटा और दवा प्रतिरोधी सी ग्लेब्राटा ईआर का सीएफयू / एमएल।डेटा को मानक विचलन (एन = 9) ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है। * पी ≤ 0.05, संबंधित जीवाणु या खमीर के लिए 0-0.7 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ पर समूहों की तुलना में काफी कम है। ^p ≤ 0.05, संबंधित सूक्ष्मजीव के लिए 0-1 mg/mL nMgO पर समूहों की तुलना में काफी कम है। #p ≤ 0.05, संबंधित सूक्ष्मजीव के लिए 0-0.5 mg/mL nMgO पर समूहों की तुलना में काफी कम है। &p ≤ 0.05, संबंधित सूक्ष्मजीव17 के लिए 0-0.3 मिलीग्राम / mL nMgO पर समूहों की तुलना में काफी कम है। यह आंकड़ा गुयेन एट अल .17 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: एफआर = फ्लुकोनाज़ोल-प्रतिरोधी; ईआर = इचिनोकैंडिन-प्रतिरोधी; एनएमजीओ = मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोकणों; सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मेथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस के लिए वास्तविक समय में लिए गए ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग (ओडी600) का प्रतिनिधित्व। 1.2 mg/mMgO, 2.9 mg/mL nMg(OH)2, 6.25 μg/mL ट्राइमेथोप्रिम, और 1.0 μg/mL वैनकोमाइसिन के 24 घंटे के लिए MRSA का जोखिम 0.025 ≤ 0.025: 0.5 घंटे पर 1.0 μg/mL वैनकोमाइसिन के संपर्क में आने वाले MRSA की वृद्धि 7.5 घंटे पर 2.9 mg/mL Mg(OH)2 के संपर्क में आने से काफी कम है। ^p ≤ 0.025: टीकाकरण के बाद 24 घंटे में 1.0 μg / mL वैनकोमाइसिन के संपर्क में आने वाले MRSA की वृद्धि 24 घंटे में 2.9 mg / mL Mg (OH)2 के संपर्क में आने वाले MRSA की वृद्धि की तुलना में काफी कम है। डेटा को माध्य ± मानक त्रुटि (एसईएम) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नमूने और नियंत्रण के संपर्क में 24 घंटे बाद सीएफयू / एमएल द्वारा व्यवहार्य मेथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस का प्रतिनिधित्व। बैक्टीरिया को 7.5 × 105 कोशिकाओं / एमएल के वास्तविक घनत्व पर बीज दिया गया था और सीएफयू / एमएल द्वारा पुष्टि की गई थी। डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में दर्शाया जाता है, एन = 3; * पी < 0.05. Equation 1 जेडसी 21 नमूनों पर सीएफयू के साथ तुलना करने पर पी < 0.05। यह आंकड़ा झांग एट अल .14 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: 1.9 ए, 1.9 एए, ईपीडी, और ए-ईपीडी, और एमजी और टीआई नियंत्रण नमूनों के सतह-उपचारित एमजी नमूनों के संपर्क में आने के 24 घंटे बाद बैक्टीरियल सीडिंग घनत्व के सीएफयू / एमएल द्वारा प्रतिनिधि परिमाणीकरण। बैक्टीरिया को 6 × 106 सीएफयू / एमएल के वास्तविक घनत्व पर बीज दिया गया था, जैसा कि लाल डैश्ड लाइन द्वारा दर्शाया गया है। डेटा को औसत ± मानक विचलन के रूप में दर्शाया जाता है; n = 3. * पी < 0.05. ठोस काली रेखा नमूना सतहों पर जीवाणु घनत्व के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण परिणामों को इंगित करती है। ब्लू डैश्ड लाइन नमूना सतहों को कवर करने वाले फिल्टर पर बैक्टीरिया घनत्व के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण परिणामों को इंगित करती है। संक्षेप: सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां; ए-ईपीडी = एनीलिंग के बाद इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव; ईपीडी = एनीलिंग से पहले इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव; ए = एनीलिंग से पहले एनोडाइजेशन; एए = एनीलिंग के बाद एनोडाइजेशन। यह आंकड़ा लिन एट अल.16 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: ग्राम-नकारात्मक ई. कोलाई और ग्राम-पॉजिटिव एस. ऑरियस की प्रतिनिधि एसईएम छवियों को 0-1.2 मिलीग्राम/एमएल एनएमजीओ के संपर्क में लाया गया। इस कारण से, 1.2 मिलीग्राम / एमएल पर एक छवि को उच्च एनएमजीओ सांद्रता के संपर्क में ई कोलाई के प्रतिनिधि के रूप में दिखाया गया है। (बी) एस ऑरियस ने भी 1.2 मिलीग्राम / एमएल से 2.0 मिलीग्राम / एमएल एनएमजीओ पर समान आकृति विज्ञान दिखाया। इस कारण से, 1.2 मिलीग्राम / एमएल पर एक छवि को उच्च एनएमजीओ सांद्रता17 के संपर्क में आने वाले एस ऑरियस के प्रतिनिधि के रूप में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 5 μm. एनएमजीओ = मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोकणों। यह आंकड़ा गुयेन एट अल .17 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: ई कोलाई की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों ने 1 दिन, 2 दिन और 3 दिनों के इनक्यूबेशन में परिमाणीकरण के साथ सब्सट्रेट्स का पालन किया। (ए) ई कोलाई की प्रतिदीप्ति छवियां 10 μM थिओफ्लेविन टी (बी) कोशिकाओं / एमएल का उपयोग करके रुचि की सामग्री के संपर्क में ई कोलाई की मात्रा का परिमाणीकरण। इनक्यूबेशन के 2 दिनों के बाद MgY_O के लिए कोई जीवाणु पालन नहीं था, और इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद एमजीवाई के पालन में कमी आई। स्केल बार = 10 μm। यह आंकड़ा लॉक एट अल.15 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की जीवाणुरोधी गतिविधियों को चिह्नित करने के लिए चार इन विट्रो विधियों (ए-डी) को प्रस्तुत किया है। जबकि इनमें से प्रत्येक विधि नैनोमटेरियल्स के जवाब में समय के साथ बैक्टीरिया के विकास और व्यवहार्यता को निर्धारित करती है, समय के साथ प्रारंभिक जीवाणु सीडिंग घनत्व, विकास और व्यवहार्यता को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों में कुछ भिन्नता मौजूद है। इनमें से तीन विधियां, प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि (ए) 17, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि (सी) 14, और केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि (डी) 16, प्रति यूनिट मात्रा में सीएफयू की गणना करके नैनोमटेरियल्स के संपर्क की अवधि के बाद बैक्टीरिया के विकास और व्यवहार्यता को निर्धारित करती हैं। इसकी तुलना में, प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि (बी) असतत वास्तविक समय ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600) माप के माध्यम से बैक्टीरिया के विकास को निर्धारित करती है। इस विधि को प्रत्यक्ष सह-संस्कृति, प्रत्यक्ष संस्कृति और केंद्रित-संपर्क जोखिम विधियों पर भी लागू किया जा सकता है यदि सीएफयू को निर्धारित करने के लिए समय की कमी है, और / या गतिज अध्ययन के लिए वास्तविक समय जीवाणु घनत्व रीडिंग की आवश्यकता होती है। यदि प्रत्यक्ष जोखिम विधि में परीक्षण किए जाने वाले जीवाणु प्रजातियों के लिए प्रभावी एंटीबायोटिक्स ज्ञात नहीं हैं, तो नैनोमटेरियल समूहों के लिए संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए सही एंटीबायोटिक दवाओं और उनके एमआईसी मूल्यों को निर्धारित करने के लिए एक साहित्य खोज की जानी चाहिए। एमआईसी मूल्यों की पुष्टि एक मानकीकरण वक्र को पूरा करके की जा सकती है, जो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री डेटा और विशिष्ट समय बिंदुओं पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के परिमाणीकरण के बीच संबंध को प्लॉट करता है। यह प्रक्रिया संबंधित ऑप्टिकल घनत्व के साथ विशिष्ट बिंदुओं पर संस्कृति में मौजूद कोशिकाओं की संख्या से संबंधित है। इसके अलावा, अंतराल-चरण विकास पर बैक्टीरिया को प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि में नैनोकणों और प्रत्यक्ष संस्कृति और केंद्रित-संपर्क जोखिम विधियों में नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों में पेश किया जाता है। इसके विपरीत, लघुगणकीय विकास चरण में बैक्टीरिया को प्रत्यक्ष जोखिम विधि में नैनोकणों में पेश किया जाता है। इसके अलावा, बैक्टीरियल सीडिंग घनत्व को प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि और केंद्रित-संपर्क जोखिम विधि में कोशिकाओं / एमएल के रूप में परिमाणित किया जाता है, जबकि बैक्टीरिया के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600) को प्रत्यक्ष जोखिम विधि में वास्तविक समय के विकास को ट्रैक करने के लिए मापा जाता है।

यद्यपि इनमें से प्रत्येक विधि ढांचे में समान है, वे बैक्टीरिया पर नैनोकणों या नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के प्रभावों को अलग करने के लिए अद्वितीय विशेषताओं को भी प्रस्तुत करते हैं। उदाहरण के लिए, प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि सीएफयू / एमएल परिमाणीकरण द्वारा नैनोकणों की पूर्व-मापा सांद्रता बढ़ाने के लिए जीवाणु प्रतिक्रियाओं की विशेषता है (चित्रा 3)। यह विधि रुचि की माइक्रोबियल प्रजातियों के लिए नैनोकणों की न्यूनतम निरोधात्मक और न्यूनतम जीवाणुनाशक सांद्रता (एमआईसी और एमबीसी) उत्पन्न करती है और, यदि कई प्रजातियों की जांच की जाती है, तो नैनोकणों की सबसे शक्तिशाली एकाग्रता (एमपीसी)17। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में नैनोकणों के अनुप्रयोग के लिए एमआईसी, एमबीसी90-99.99 और एमपीसी की पहचान आवश्यक है। उदाहरण के लिए, इन आंकड़ों को साइटोकम्पैटिबिलिटी बनाए रखते हुए नैनोपार्टिकल जीवाणुरोधी गतिविधि की विवो परीक्षाओं में लागू किया जा सकता है जब कम-से-घातक सांद्रता की भी पहचान की गई है। इसके विपरीत, प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि नैनोपार्टिकल गतिविधि को बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक के रूप में इस तरह से दर्शाती है जो एंटीबायोटिक दवाओं के वर्गीकरण के समान है, जहां अनुसंधान या नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग से पहले सहक्रियात्मक या अवांछनीय प्रभावों की पहचान की जानी चाहिए।

बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक के रूप में जीवाणुरोधी यौगिकों का लक्षण वर्णन नैदानिक उपयोग और इन विट्रो और विवो अनुसंधान 38 में प्रासंगिक है। इस कारण से, इन विशेषताओं की जांच करने के तरीकों को डिजाइन करते समय, परिणामों को प्रभावित करने वाले किसी भी नकारात्मक प्रभाव की पहचान की जानी चाहिए। यहां, प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व के वास्तविक समय माप का उपयोग करके विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों के लिए नैनोकणों को बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक के रूप में वर्गीकृत करती है (चित्रा 4)। लघुगणकीय विकास चरण में बैक्टीरिया को बैक्टीरिया और नैनोपार्टिकल निलंबन बनाने के लिए एमआईसी स्तर पर नैनोकणों के साथ मिलाया जाता है। बैक्टीरिया पर नैनोपार्टिकल एक्सपोजर के चल रहे प्रभावों को निर्धारित करने के लिए इन निलंबनों को वास्तविक समय में सावधानीपूर्वक मापा जाता है। प्राप्त परिणामों को सत्यापित करने के लिए, बैक्टीरियोस्टेटिक और जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ निलंबन में समवर्ती रूप से उगाए गए बैक्टीरिया नैनोपार्टिकल-उजागर बैक्टीरिया की वृद्धि दर की पुष्टि करने के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करते हैं।

बायोइंजीनियरिंग, नैदानिक और पर्यावरण विज्ञान में नैनोकणों के समावेश की दूरगामी संभावनाएं हो सकती हैं, लेकिन इन विट्रो के लिए नैनोकणों के जीवाणुरोधी डेटा का उपयोग करना और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों पर विवो अध्ययन में पूरा करना चुनौतीपूर्ण है। इस कारण से, हमने नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की इन विट्रो जीवाणुरोधी गतिविधियों को चिह्नित करने के लिए प्रत्यक्ष संस्कृति और केंद्रित-संपर्क जोखिम विधियों को प्रस्तुत किया। प्रत्यक्ष संस्कृति विधि नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के जीवाणुरोधी प्रभावों की जांच करती है जबबैक्टीरिया रुचि की सामग्री के साथ सीधे संपर्क में होते हैं। यहां, आरएसबीएफ प्लस 10% एफबीएस में निलंबित बैक्टीरिया नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के संपर्क में आते हैं, इसके बाद सतह के सीधे संपर्क में बैक्टीरिया के लिए समय के साथ बैक्टीरिया के विकास का परिमाणीकरण होता है और सीएफयू / एमएल का उपयोग करके रुचि की सामग्री (अप्रत्यक्ष संपर्क) के आसपास निलंबन होता है। इससे पहले, मैग्नीशियम मिश्र धातु नैनोस्ट्रक्चर (जेडसी 21 और जेडएसआर 41 मिश्र धातुओं) से जुड़े प्रयोगात्मक परिणामों ने संकेत दिया है कि जीवाणुरोधी गतिविधियां बढ़ जाती हैं जब बैक्टीरिया अप्रत्यक्ष संपर्क की तुलना में नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के सीधे संपर्क में होते हैं, जहां बैक्टीरिया बिनाकिसी संपर्क के निलंबन में रहते हैं (चित्रा 5)। अंत में, केंद्रित-संपर्क विधि बैक्टीरिया के इंटरफ़ेस और एक नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह16 पर जीवाणुरोधी गतिविधि की विशेषता है। यहां, हमने समय के साथ बैक्टीरिया के आसंजन और बायोफिल्म गठन के संभावित व्यवधान को निर्धारित करने के लिए एक बायोरिजेनरेटेबल मैग्नीशियम मिश्र धातु की सतह पर जमा मैग्नीशियम ऑक्साइड एनोडाइज्ड या इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से जांच की। बायोफिल्म गठन का विघटन रोगी उपचार प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है क्योंकि बायोफिल्म मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और एंटीबायोटिक उपचारों से बचतेहैं और इसके परिणामस्वरूप संक्रमण होता है जिसका इलाज करना बेहद मुश्किल होता है।

यहां, हम जापानी औद्योगिक मानक जेआईएस जेड 2801: 200016 से अनुकूलित एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि सुनिश्चित करती है कि बैक्टीरिया बाँझ नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर पेपर से जुड़े होते हैं, जिसके बाद नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह के एक निश्चित क्षेत्र के संपर्क में आते हैं। यह जीवाणुरोधी गतिविधि पर सतह के प्रभाव के लक्षण वर्णन को केवल परीक्षण क्षेत्र तक सीमित करता है। प्रतिनिधि परिणामों में, एनीलिंग (1.9 ए) से पहले एनोडाइजेशन, एनीलिंग (1.9एए) के बाद एनोडाइजेशन और एनीलिंग (ईपीडी) नमूनों से पहले इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव ने मैग्नीशियम, टाइटेनियम और ग्लास नियंत्रण नमूनों की तुलना में बैक्टीरिया के विकास को कम करने के साथ-साथ उनके संबंधित फिल्टर पेपर पर महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया। एनीलिंग (ए-ईपीडी) नमूनों के बाद इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव बैक्टीरिया के विकास को कम करने में भी प्रभावी था, लेकिन यह परिणाम 1.9 ए, 1.9 एए और ईपीडी नमूने16 (चित्रा 6) के लिए प्राप्त परिणामों की तुलना में कम महत्वपूर्ण था।

सारांश में, यहां प्रस्तुत प्रत्येक इन विट्रो विधि मास्टर करने के लिए यथोचित आसान है और सस्ती और आसानी से उपलब्ध सामग्रियों को शामिल करती है। इन विधियों का उपयोग नैनोमटेरियल्स और माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच बातचीत को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है जो शोधकर्ताओं के लिए रुचि रखते हैं। अनुसंधान उद्देश्यों को पूरा करने के लिए इष्टतम प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए इन विधियों के बीच समानता और अंतर को समझना आवश्यक है। यहां, इन इन विट्रो विधियों से प्राप्त वैज्ञानिक ज्ञान को डाउनस्ट्रीम चिकित्सा अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है जहां एंटीबायोटिक्स सीमित होना चाहिए या एक प्रतिकूल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अमेरिकी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ सीबीईटी पुरस्कार 1512764 और एनएसएफ पीआईआरई 1545852), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच एनआईडीसीआर 1आर03डीई028631), कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (यूसी) रीजेंट्स फैकल्टी डेवलपमेंट फैलोशिप, रिसर्च सीड ग्रांट (हुइनन लियू) पर समिति और पेट्रीसिया होल्ट-टोरेस को दिए गए यूसी-रिवरसाइड ग्रेजुएट रिसर्च मेंटरशिप प्रोग्राम ग्रांट से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं। लेखक एसईएम /ईडीएस के उपयोग के लिए यूसी-रिवरसाइड में सेंट्रल फैसिलिटी फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी एंड माइक्रोएनालिसिस (सीएफएएमएम) और एक्सआरडी के उपयोग के लिए डॉ पेरी चेउंग द्वारा प्रदान की गई सहायता की सराहना करते हैं। लेखक प्रयोगों और डेटा विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए मॉर्गन एलिजाबेथ नेटर और संहिता तुमकुर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस लेख में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन या राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

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References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 194 रोगाणुरोधी नैनोकणों नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) न्यूनतम जीवाणुनाशक एकाग्रता (एमबीसी) खुराक-निर्भर जीवाणु बैक्टीरिया
<em>इन विट्रो में</em> नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन
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Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

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