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Bioengineering

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

Abstract

은, 산화 아연, 이산화 티타늄 및 산화 마그네슘과 같은 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성은 이전에 임상 및 환경 환경과 소모성 식품에서 탐구되었습니다. 그러나 사용된 실험 방법과 재료의 일관성 부족은 동일한 나노 구조 유형과 박테리아 종에 대한 연구 사이에서도 상충되는 결과를 낳았습니다. 나노 구조를 제품 설계에서 첨가제 또는 코팅으로 사용하려는 연구자의 경우 이러한 상충되는 데이터는 임상 환경에서의 활용을 제한합니다.

이 딜레마에 맞서기 위해 이 기사에서는 나노 입자와 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 네 가지 방법을 제시하고 다양한 시나리오에서 적용 가능성에 대해 논의합니다. 일관된 방법을 적용하면 연구 전반에 걸쳐 비교하고 다양한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 대해 구현할 수 있는 재현 가능한 데이터로 이어질 것으로 예상됩니다. 나노입자의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법과 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법을 소개합니다.

나노 입자의 경우, 직접 공동 배양 방법을 사용하여 나노 입자의 최소 억제 및 최소 살균 농도를 결정할 수 있으며, 직접 노출 배양 방법을 사용하여 나노 입자 노출로 인한 실시간 정균 대 살균 활성을 평가할 수 있습니다. 나노 구조 표면의 경우, 직접 배양 방법은 나노 구조 표면과 간접적으로 직접 접촉하는 박테리아의 생존 가능성을 결정하는 데 사용되며, 초점 접촉 노출 방법은 나노 구조 표면의 특정 영역에서 항균 활성을 검사하는 데 사용됩니다. 우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 특성을 결정할 때 시험관 내 연구 설계를 위해 고려해야 할 주요 실험 변수에 대해 논의합니다. 이러한 모든 방법은 상대적으로 비용이 저렴하고 비교적 마스터하기 쉽고 일관성을 위해 반복 가능한 기술을 사용하며 광범위한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 적용할 수 있습니다.

Introduction

미국에서만 매년 170만 명이 병원 획득 감염(HAI)을 일으키며, 이 중 17건 중 1건이 사망에 이른다1. 또한 HAI의 치료 비용은 연간 280억 달러에서 450억 달러에 이르는 것으로 추정됩니다 1,2. 이러한 HAI는 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)3,4 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)4에 의해 우세하며, 이들은 일반적으로 만성 상처 감염으로부터 분리되며, 일반적으로 유리한 환자 결과를 얻기 위해 광범위한 치료와 시간이 필요합니다.

지난 수십 년 동안 이러한 박테리아 및 기타 병원성 박테리아와 관련된 감염을 치료하기 위해 여러 항생제 종류가 개발되었습니다. 예를 들어, 리파마이신 유사체는 MRSA, 다른 그람 양성 및 그람 음성 감염, 및 Mycobacterium spp. 감염을 치료하기 위해 사용되어 왔다5. 1990년대에는 증가하는 M. tuberculosis 감염을 효과적으로 치료하기 위해 추가 약물을 리파마이신 유사체와 결합하여 효과를 높였습니다. 그러나, 결핵균 감염자의 약 5%는리팜피신에 내성이 남아 있으며5,6, 다제내성균에 대한 우려가 증가하고 있다7. 현재, 항생제 단독으로는 HAI 치료에 충분하지 않을 수 있으며, 이로 인해 대체 항균 요법에 대한 지속적인 연구가 촉발되었다1.

은(Ag)8,9,10 및 금(Au)11과 같은 중금속과 이산화티타늄(TiO2)12 및 산화아연(ZnO)13과 같은 세라믹은 나노입자(NP) 형태(각각 AgNP, AuNP, TiO2 NP 및 ZnONP)는 항균 활성에 대해 조사되었으며 잠재적인 항생제 대안으로 확인되었습니다. 또한, 마그네슘 합금 (Mg 합금) 14,15,16, 산화 마그네슘 나노 입자 17,18,19,20,21 및 수산화 마그네슘 나노 입자 [각각 nMgO 및 nMg (OH) 2]22,23,24 , 또한 조사되었습니다. 그러나 나노 입자에 대한 이전의 항균 연구는 일관되지 않은 재료와 연구 방법을 사용하여 비교하기 어렵거나 불가능하고 때로는 본질적으로 모순되는 데이터를 생성했습니다18,19. 예를 들어,은 나노 입자의 최소 억제 농도 (MIC)와 최소 살균 농도 (MBC)는 다른 연구에서 크게 달랐다. Ipe et al.25는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 MIC를 결정하기 위해 ~26nm의 평균 입자 크기를 갖는 AgNP의 항균 활성을 평가했습니다. 녹농균, 대장균, 황색포도상구균 및 MRSA에 대해 확인된 MIC는 각각 2μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL 및 10μg/mL였습니다. 대조적으로, Parvekar et al.26은 평균 입자 크기가 5nm인 AgNP를 평가했습니다. 이 경우 AgNP MIC와 0.625mg/mL의 MBC가 S. 아우레우스에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 또한, Loo et al.27은 4.06 nm 크기의 AgNPs를 평가하였다. 대장균이 이러한 나노 입자에 노출되었을 때 MIC와 MBC는 7.8 μg / mL로보고되었습니다. 마지막으로 Ali et al.28은 평균 크기가 18nm인 구형 AgNP의 항균 특성을 조사했습니다. 녹농균, 대장균 및 MRSA가 이들 나노입자에 노출되었을 때, MIC는 각각 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL 및 36 μg/mL에서 확인되었고, MBC는 각각 36 μg/mL, 42 μg/mL 및 30 μg/mL에서 확인되었다.

나노 입자의 항균 활성은 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 보고되었지만 연구 전반에 걸쳐 직접 비교할 수 있는 재료 및 연구 방법에 대한 표준은 없습니다. 이러한 이유로 우리는 재료와 방법을 일관되게 유지하면서 나노 입자의 항균 활성을 특성화하고 비교하기 위해 직접 공동 배양 방법 (방법 A)과 직접 노출 방법 (방법 B)의 두 가지 방법을 제시합니다.

나노 입자 외에도 나노 구조 표면도 항균 활성에 대해 조사되었습니다. 여기에는 그래핀 나노시트, 탄소 나노튜브, 흑연29와 같은 탄소 기반 재료와 순수 Mg 및 Mg 합금이 포함됩니다. 이들 물질 각각은 탄소 기반 물질에 의해 세포막에 가해지는 물리적 손상 및 Mg가 분해될 때 활성 산소종(ROS)의 방출을 통한 대사 과정 또는 DNA 손상을 포함하여 적어도 하나의 항균 메커니즘을 나타냈습니다. 또한, 아연(Zn)과 칼슘(Ca)이 Mg 합금의 형성에 결합될 때, Mg 매트릭스 입자 크기의 미세화가 향상되고, 이는 Mg-단독 샘플(14)에 비해 기판 표면에 대한 박테리아 접착의 감소로 이어진다. 항균 활성을 입증하기 위해 직접 및 간접 표면 접촉을 통한 박테리아 집락 형성 단위(CFU)의 정량화를 통해 시간 경과에 따른 나노 구조 물질 위와 주변의 박테리아 부착을 결정하는 직접 배양 방법(방법 C)을 제시합니다.

크기, 모양 및 방향을 포함한 표면의 나노 구조의 기하학은 재료의 살균 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, Lin et al.16 은 양극 산화 및 전기 영동 증착 (EPD)을 통해 Mg 기판의 표면에 상이한 나노 구조 MgO 층을 제조했다. 시험관 내에서 나노구조화된 표면에 일정 기간 노출된 후, S. 아우레우스 의 성장은 처리되지 않은 Mg에 비해 실질적으로 감소되었다. 이것은 처리되지 않은 금속 Mg 표면에 비해 박테리아 접착에 대한 나노 구조 표면의 더 큰 효능을 나타냅니다. 다양한 나노 구조 표면의 항균 특성의 다양한 메커니즘을 밝히기 위해 관심 영역 내에서 세포-표면 상호 작용을 결정하는 집속 접촉 노출 방법(방법 D)이 이 기사에서 논의됩니다.

이 기사의 목적은 서로 다른 나노 입자, 나노 구조 표면 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 제시하는 것입니다. 비교 가능성을 위해 일관되고 재현 가능한 데이터를 생성하기 위해 각 방법에 대한 주요 고려 사항에 대해 논의합니다. 구체적으로, 나노입자의 항균성을 조사하기 위해 직접공배양법(17)과 직접노광법이 사용된다. 직접 공동 배양 방법을 통해 개별 종에 대해 최소 억제 및 최소 살균 농도(각각 MIC 및 MBC90-99.99)를 결정할 수 있으며 여러 종에 대해 가장 강력한 농도(MPC)를 결정할 수 있습니다. 직접 노출 방법을 통해 최소 억제 농도에서 나노 입자의 정균 또는 살균 효과는 시간 경과에 따른 실시간 광학 밀도 판독값으로 특성화할 수 있습니다. 직접 배양14 방법은 나노 구조 표면과 직접 및 간접적으로 접촉하는 박테리아를 검사하는 데 적합합니다. 마지막으로, 박테리아의 직접 적용과 세포-나노 구조 계면에서의 박테리아 성장의 특성화를 통해 나노 구조 표면의 특정 영역의 항균 활성을 조사하기 위해 초점 접촉 노출16 방법이 제시됩니다. 이 방법은 일본 산업 표준 JIS Z 2801:200016에서 수정되었으며 미생물-표면 상호 작용에 초점을 맞추고 미생물 배양에서 벌크 샘플 분해가 항균 활성에 미치는 영향을 배제하기 위한 것입니다.

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Protocol

직접 공동 배양 및 직접 노출 방법을 제시하기 위해 산화 마그네슘 나노 입자 (nMgO)를 모델 재료로 사용하여 박테리아 상호 작용을 입증합니다. 직접 배양 및 집중 접촉 노출 방법을 제시하기 위해 나노 구조 표면이 있는 Mg 합금을 예로 사용합니다.

1. 나노 물질의 살균

참고: 모든 나노 물질은 미생물 배양 전에 멸균 또는 소독해야 합니다. 사용할 수 있는 방법에는 열, 압력, 방사선 및 소독제가 포함되지만 시험관 내 실험 전에 각 방법에 대한 재료의 허용 오차를 확인해야 합니다.

  1. 나노 입자
    알림: 샘플은 에탄올과 같은 유기 용매에 보관하거나 접시나 상자에 포장한 다음 적절한 방식으로 멸균 또는 소독할 수 있습니다. 나노입자는 직접공배양법17 과 직접노광법의 실증을 위해 다음과 같은 방법을 이용하여 멸균하였다.
    1. MgO 나노입자를 200°C 컨벡션 오븐30에서 60 분 동안 멸균하여 각 in vitro 실험에 앞서 수행하였다.
      참고: 이 방법은 수증기와 자외선이 MgO 나노입자(nMgO)17의 구조에 영향을 미칠 수 있기 때문에 선택되었습니다.
  2. 벌크 재료
    참고: 나노 구조 물질은 직접 배양 방법을 시연하기 위해 다음과 같은 방법으로 멸균되었습니다.
    1. 직접 배양 방법14의 경우, 시험관 내 연구를 시작하기 전에 자외선(UV) 방사선을 사용하여 준비된 ZC21, Mg 및 T64 샘플을 4시간 동안 소독합니다.
    2. 초점 접촉 노출 방법16의 경우, 시험관 내 연구를 시작하기 전에 2시간 동안 UV 방사선을 사용하여 모든 샘플을 소독합니다.
  3. 또는 열에 민감한 물질의 살균을 위해 에틸렌 옥사이드(EtO)를 사용합니다.

2. 직접 공배양법(방법 A)

참고: 방법 A에서는 지연 단계 파종 배양의 박테리아가 특정 농도의 나노 입자와 직접 혼합됩니다. 나노 입자 항균 활성을 검사하기 위해 Nguyen et al.17에 의해 설명 된 프로토콜을 따릅니다.

  1. 나노입자 및 나노구조의 특성화
    참고: 나노 구조 조성 및 형태는 X선 분말 회절을 사용하여 확인됩니다.
    1. 나노 입자의 측정
      1. 3mL 샘플을 세 번 수용하기 위해 mL당 원하는 질량의 9배로 나노입자의 무게를 잰다. 예를 들어, 1.8mg/mL에서 0.2mg/mL nMgO의 무게를 잰다.
        참고: 이것은 박테리아 배양물과 국물에서 나노 입자의 일관된 분포를 보장합니다.
      2. 분석 저울을 사용하여 미리 칭량하고 타르를 처리한 5.0mL 미세 원심분리기 튜브에서 모든 나노 입자를 측정합니다.
  2. 박테리아 배양 준비 및 성장
    1. 각각의 시험관내 실험에 대해, -80°C에서 저장고로부터 박테리아 세포 스톡을 회수한다. 각 박테리아 세포 스톡 10μL를 적절한 성장 배지 5mL에 추가합니다.
    2. 접종된 배지를 37°C 및 250rpm에서 하룻밤 동안 인큐베이터-셰이커에 넣습니다.
      1. 포도상구균 종이 자란 경우 각 하룻밤 배양액 400μL를 20mL의 신선한 성장 배지(100μL/5mL 배지)에 넣고 추가로 4-6시간 동안 37°C 및 250rpm에서 진탕하면서 배양합니다.
  3. 파종 밀도를 결정하기 위해 박테리아 세포를 세척하고 계수합니다
    참고: 7.8 × 106 CFU/mL의 원하는 파종 밀도는 요로 감염을 확인하는 데 필요한 것보다 큰 세포 수로 확인되었습니다.
    1. 하룻밤 동안 배양된 박테리아 1mL를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취하여 배양된 박테리아를 수집합니다. 하룻밤 박테리아 배양에서 충분한 수의 분취량을 생성하고 원하는 파종 밀도에 도달하기 위해 1,956 × g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
    2. 원심분리 후, 펠릿화된 세포로부터 상청액을 제거하기 위해 피펫팅하고, 상청액을 수집 용기에 넣는다. 세포 펠릿을 0.5mL의 신선한 성장 배지에 재현탁합니다. 2개의 0.5mL 현탁액을 결합하여 1mL의 현탁액을 만들어 재현탁 세포의 1mL 분취량 수를 6개로 줄입니다. 1,956 × g에서 10 분 동안 원심 분리를 반복한다.
    3. 단계 2.3.2에서와 같이 신선한 성장 배지를 사용하여 두 번째 세척 사이클을 완료하여 재현탁된 세척된 세포의 1mL 분취량 수를 3개로 줄입니다.
    4. 세포 펠렛을 0.33 mL의 트리스 완충액(Tris buffer, pH 8.5)에 재현탁시키는 것을 제외하고는 단계 2.3.2에서와 같이 3차 사이클을 완료한다. 각각 0.33mL 부피의 3개의 현탁액을 하나의 1.5mL 미세원심분리기로 결합합니다. 1,956 × g에서 10 분 동안 원심 분리를 반복한다.
      참고: 트리스 완충액에는 Mg 2+ 또는 Ca2+ 이온31이 포함되어 있지 않습니다. 이는 유도 결합 플라즈마-광학 방출 분광법(ICP-OES)을 사용하여 배양 후 배양액에서 Mg 2+ 및 Ca2+ 이온을 측정하는 데 중요합니다. 대조적으로, 인산염 완충 식염수(PBS)32에 존재하는 인산염은 예를 들어 Mg 2+ 또는 Ca2+ 이온33,34,35를 모두 격리하고 ICP-OES 데이터의 해석에 혼란을 야기합니다.
    5. 펠렛화된 세포에서 상청액을 제거합니다. 세포 현탁액으로 알려진 1mL의 신선한 트리스 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    6. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액 농도(cells/mL)를 측정합니다.
  4. 파종 박테리아 배양 생성
    참고: 샘플의 총 부피는 3mL이며 세 번(총 9mL) 완성됩니다.
    1. 필요한 박테리아 파종 배양의 총량을 결정합니다. 파종 배양을 생성하려면 C 1 V1= C 2 V2를 사용하여 7.8 ×10 6 cells/mL의 파종 배양을 만드는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다. 세포 현탁액의 계산된 부피(V1)를 필요한 성장 배지(V2)의 부피에 추가합니다.
    2. 실제 박테리아 파종 밀도를 CFU/mL 단위로 결정합니다. 10-4로 10 배의 연속 희석을 만듭니다. 10-4 희석액을 적절한 성장 한천에 펼치고 밤새 배양합니다. 배양 후 콜로니 수를 세고 CFU/mL를 계산합니다.
  5. 박테리아 및 나노 입자 배양의 형성
    1. 12-웰, 비조직 처리된 폴리스티렌 플레이트에서, 필요한 웰 수에 대해 각 웰에서 박테리아 파종 배양 물 2mL를 분취합니다.
    2. 미리 칭량된 nMgO가 들어 있는 각 5mL 미세원심분리기 튜브에 박테리아 파종 배양액 3mL를 추가합니다. nMgO를 박테리아와 혼합하기 위해 잠시 소용돌이. 혼합물 1 mL를 3개의 개별 웰에 분취하여 nMgO의 미리 측정된 각 중량의 3중 샘플을 만들었다. 현탁액에서 nMgO를 유지하기 위해 각 1mL 분취량을 만들기 전에 박테리아/nMgO 혼합물을 2-3배 피펫합니다.
      참고: 대조군 샘플은 3mL의 세포만, 3mL의 배지만, 3mL의 나노입자 및 가장 낮은 농도와 가장 높은 농도의 나노입자를 포함하는 3mL로 구성됩니다. 이들은 2.5.2 단계에서와 같이 준비됩니다. 모든 대조 샘플은 세 번 완성됩니다.
    3. 모든 12-웰 플레이트를 37°C 및 120rpm에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
  6. nMgO에 노출된 후 박테리아 세포 성장 결정
    1. 박테리아 배양물을 하룻밤 동안 배양한 후 개별 15mL 원뿔형 튜브에 피펫팅하여 3mL마다 샘플을 수집합니다.
    2. 96웰 플레이트를 사용하여 1:10 연속 희석을 만듭니다. 박테리아가 포함된 모든 샘플을 연속적으로 희석하는 데 필요한 컬럼 수를 결정합니다. 적절한 수의 컬럼에 대해 180μL의 Tris 버퍼를 행 B에서 행 G의 각 웰에 추가합니다.
    3. 박테리아 샘플이 들어 있는 각 15mL 원뿔형 튜브를 간략하게 소용돌이치고 행 A의 개별 웰에 50μL를 추가합니다.
    4. 행 A의 각 웰에 대해 20 μL를 행 B(예: A1에서 B1)로 옮기고 피펫팅으로 간단히 혼합하여 200 μL의 부피를 얻습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 20μL를 B열의 웰에서 C열의 웰로 옮깁니다. G열의 웰에 200μL가 포함될 때까지 이 패턴을 계속합니다. B열의 10-1 에서 G열의 10-6 까지 연속 희석을 완료합니다.
    5. 각 웰의 피펫 100 μL를 적절한 성장 한천 플레이트 상에 퍼뜨리고 플레이트를 가로질러 분산시켜 세포 배양액을 분산시켰다. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이터-셰이커에 넣습니다. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
    6. 판을 검사하고 약 25-300 개의 식민지가있는 판을 세십시오. 가능하면 동일한 희석 값의 플레이트를 선택하십시오. 플레이트당 콜로니 수를 사용하여 CFU/mL를 계산합니다.
  7. 배양 후 pH의 평가
    알림: 각 pH 측정기 모델에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
    1. pH 4, pH 7 및 pH 10의 표준화 용액을 사용하여 pH 측정기를 사전 교정합니다. pH 프로브를 15mL 원뿔형 튜브에 넣어 각 박테리아 샘플을 판독합니다.
  8. ICP-OES용 시료 준비
    참고: ICP-OES는 Mg 2+ 및 Ca2+ 이온의 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 양이온은 각각 세포 대사에 참여하기 때문에 중요한 것으로 간주됩니다.
    1. 단계 2.6.1에서 제조된 각 15 mL 원뿔형 튜브를 5,724 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 및 나노입자 파편을 펠렛화하였다.
    2. 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 상층액 30μL를 18.2 Ω 여과수 2.97mL에 희석하여 1:100 희석을 만듭니다.
      알림: 희석 계수는 투영된 이온 농도와 분광계 기기의 검출 한계에 따라 조정할 수 있습니다.
    3. ICP-OES를 사용하여 샘플을 읽어 보십시오.

3. 직접 노출 방법(방법 B)

참고: 선택한 박테리아의 성장률을 알 수 없는 경우 이 방법을 구현하기 전에 성장 곡선의 표준화를 완료해야 합니다.

  1. 관심 나노입자에 노출될 때 실시간 정균 및 살균 활성을 결정합니다.
    1. 단계 2.1-2.1.2.2에 기술된 방법을 사용하여 원하는 농도의 나노입자를 제조한다. 사용할 나노 입자의 각 중량 2 세트를 준비하십시오 : 하나는 대수 성장 단계에서 박테리아 배양 균 분취량 3 mL에 첨가하고, 다른 하나는 대조군으로 박테리아가없는 성장 배지 분취량 3 mL에 첨가합니다.
    2. 테스트할 박테리아 종에 대한 적절한 정균 및 살균 항생제를 결정합니다.
      참고: 각 항생제의 최소 억제 농도에 대한 지식이 필요합니다.
  2. 모든 나노입자, 항생제 및 대조군 시료에 대해 3mL 시료를 세 번 복제하는 데 필요한 박테리아 배양의 총 부피를 계산합니다.
    참고: 동일한 부피의 멸균 성장 배지가 필요합니다. 분광광도계의 사용을 계획하는 경우, 큐벳에 필요한 0.5mL에서 1.0mL 부피를 수용하는 데 필요한 총 부피를 조정해야 합니다.
  3. 1일차: 각 시험 관 내 실험에 대해 2.2.1-2.2.2 단계에 따라 야간 재고를 생성합니다.
  4. 2일차: 플레이트 리더 설정이 광학 밀도가 600nm인 96웰 플레이트를 수용할 수 있는지 확인합니다. 96웰 플레이트를 사용하여 200μL 분취량의 샘플을 측정합니다.
    1. 나노입자 및 항생제를 첨가하기 전에 초기 배양 기간을 시작하는데 사용된 밀도 - 0.01에서 초기 세균 배양OD600 을 결정한다.
    2. 인큐베이터 셰이커에서 하룻밤 동안 박테리아 배양을 수집합니다.
      1. 테스트할 각 물질(예: 사전 측정된 나노입자 또는 항생제)에 대해 0.01의OD600 에서 별도의 박테리아 배양을 만듭니다. 필요한 세포 배양 부피를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 용기(예: 멸균된 삼각 플라스크 또는 50mL 원뿔형 튜브)를 사용합니다.
      2. 성장 배지의 200μL 분취액 3개를 3개의 웰에 넣고 박테리아 배양액의 200μL 분취액 3개를 추가 웰(예: A1 - A6)에 배치하여 하룻밤 동안 박테리아 샘플을 성장 배지로 희석합니다.
      3. 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 스캔합니다.
        알림: 판독값은 평균값을 생성하기 위해 스캔된 각 웰에 대해 평균화됩니다.
      4. 현탁액의 박테리아 밀도를 계산하려면 삼중 샘플이 포함된 각 웰의 평균값을 평균하십시오.
      5. 박테리아의 광학 밀도를 결정하려면 박테리아 평균에서 배양액 샘플 평균을 뺍니다.
      6. 박테리아 현탁액을 계속 조정해야 하는 경우 필요에 따라 브로스 또는 하룻밤 박테리아 배양을 계속 추가하고 약0.01의 OD 600 에 도달할 때까지 필요에 따라 플레이트 리더에서 스캔을 반복합니다.
      7. 대수 성장에 도달할 때까지 150rpm으로 진탕하면서 37°C에서 배양합니다.
  5. 인큐베이터 셰이커에서 박테리아 배양액을 제거합니다.
    1. OD600 0.01 박테리아 배양액 3mL를 테스트 및 대조군 샘플을 위해 표지된 15mL 원뿔형 튜브에 세 번 분취합니다.
    2. 박테리아 배양액을 200 μL의 분취하여 96-웰 플레이트의 3개의 웰에 넣고, 플레이트 리더를 이용하여 샘플을 측정하였다.
    3. 이전에 3.4.2.2 단계 및 3.4.2.6 단계에서 설명한 대로 "-0.5 h 판독값"을 계산합니다.
  6. 박테리아/나노입자 혼합물의 생성 및 측정
    1. 박테리아 배양과 동일한 수의 멸균 성장 배지 3mL를 대조군 샘플(3회)을 위해 표지된 15mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
    2. 박테리아/나노입자 현탁액 및 멸균 배지/나노입자 현탁액을 준비하려면 15mL 원뿔형 튜브의 각 삼중 세트에서 박테리아 배양 또는 배지 1mL를 제거합니다.
      1. 미리 측정된 나노입자가 들어 있는 5 mL 원심분리 튜브에 1 mL 분취량을 넣고, 간단히 와동하여 혼합한다.
      2. 5mL 원심분리기 튜브에서 박테리아/나노입자 또는 배지/나노입자 현탁액의 1mL 분취량을 15mL 원뿔형 튜브로 되돌려 나노입자를 균질하게 분배합니다.
        참고: 각 1mL 분취액을 피펫팅하기 전에 박테리아/나노입자 혼합물을 2x-3x 피펫팅하여 나노입자를 현탁액으로 유지합니다.
  7. 박테리아/항생제 혼합물의 생성 및 측정
    1. 박테리아/항생제 배양을 만들기 위해 배양된 박테리아 배양액 3mL를 해당 라벨이 붙은 15mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
    2. 모든 샘플이 준비된 후, 각 샘플의 200 μL를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 분취한다.
    3. 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 스캔을 시작합니다("0시간" 판독).
    4. 샘플이 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브를 37°C 및 150rpm에서 인큐베이터-쉐이커에 넣습니다. 3.4.2.2 단계 및 3.4.2.6 단계에서 설명한 대로 모든 데이터를 기록합니다.
  8. 15시간 판독을 완료한 후 약 0분 후에 3.7.2-3.7.3단계-"0.5시간" 판독에 설명된 단계를 반복합니다.
    1. 설정된 0 h 후, 단계 3.7.2-단계 3.7.3에 설명된 단계를 6 사이클 동안 90분마다 반복하고; 9 시간 내에 완료하십시오.
    2. 여섯 번째 사이클이 완료된 후, 샘플을 37°C 및 150rpm에서 추가로 15시간 동안 인큐베이터-쉐이커에 넣습니다. 3.7.2-3.7.3 단계에서 설명한 단계를 반복하여 24시간 판독값을 얻습니다. 3.4.2.2 단계 및 3.4.2.6 단계에서 설명한 대로 모든 데이터를 기록합니다.

4. 직접 배양 방법(방법 C)

참고: 방법 C에서는 지연 단계 파종 배양의 박테리아를 관심 있는 나노 구조 표면에 직접 배치합니다. 나노구조 항균 활성을 검사하기 위해, 본 발명자들은 Zhang et al.14에 의해 기술된 프로토콜을 따른다. 이 직접 배양 방법을 입증하기 위해 ZC21(Mg-Zn-Ca 합금) 및 Mg 핀을 샘플로 사용했습니다.

  1. 박테리아 배양 준비 및 성장
    1. 각 시험관 내 실험에 대해 2.2.1-2.2.2 단계에 따라 야간 재고를 생성합니다.
  2. 파종 밀도를 결정하기 위해 박테리아를 세척하고 계수합니다
    참고: 7.5 ×10 5 CFU/mL의 원하는 파종 밀도는 정형외과 감염을 유발하는 보고된 세포 농도로 확인되었다14.
    1. 인큐베이터 셰이커에서 하룻밤 동안 박테리아 배양을 회수합니다.
    2. 2.3.2-2.3.2.3 단계에 따라 박테리아를 세척하고 수집하되 각 세척 단계에 대해 새로운 배지를 수정된 모의 체액(rSBF)으로 교체합니다.
      참고: rSBF는 인간 혈장의 이온 농도를 모방한 완충 용액입니다. 그러나 rSBF는 무기 화합물만을 포함하고 단백질과 같은 생체 유기 화합물은 없습니다. 이를 해결하기 위해, 소 태아 혈청(FBS)을 rSBF와 결합하여 인간 혈액의 조성을 시뮬레이션하여 실험 조건 하에서 석회화된 조직에서 인회석의 자연적 형성을 더 잘 모방한다36.
    3. 펠렛화된 세포에서 상청액을 제거합니다. 10% FBS가 보충된 rSBF 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    4. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액 농도(cells/mL)를 측정합니다. 세포 현탁액을 7.5% FBS가 보충된 rSBF에서 10× 5 cells/mL의 농도로 희석합니다. 2.4.1단계에 따라 시드 문화권을 만듭니다.
    5. 2.4.2 단계에 따라 실제 파종 밀도를 결정하십시오.
  3. 박테리아 세포 현탁액을 배양 웰의 샘플에 분배합니다.
    1. 샘플과 대조군 샘플을 모두 48웰, 비조직 처리된 폴리스티렌 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.
    2. 0.75 mL의 세포 현탁액을 샘플 및 대조군이 들어있는 각 웰에 분취하였다. 48웰 플레이트를 120rpm으로 진탕하면서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이터-셰이커에 넣습니다.
  4. 박테리아 농도의 특성 분석
    1. 24시간 배양 후 샘플을 수집하여 별도의 라벨이 붙은 수집 튜브에 넣습니다.
    2. 각 그룹에서 두 개의 샘플을 수집하고 라벨이 붙은 5.0mL 미세 원심분리기 튜브에 개별적으로 넣습니다. 각 튜브에 2mL의 rSBF를 추가합니다.
    3. 4.4.2 단계에서 수집 한 샘플을 초음파 처리 욕조에 넣고 10 분 동안 초음파 처리합니다. 각 5분 간격 후, 각 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다.
    4. 새로 분리된 박테리아 세포가 포함된 rSBF를 수집하고 현탁액을 라벨이 붙은 신선한 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
  5. 박테리아를 연속 희석 및 도금
    1. 2.6.2-2.6.6 단계에 따라 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하고 플레이트에 넣습니다.
  6. 단계 2.7에 따라 배양 배지의 배양 후 pH를 평가합니다.
  7. 단계 2.8에 설명된 방법에 따라 ICP-OES에 대한 배양 후 배지를 준비합니다.

5. 초점 접촉 노광법(방법 D)

참고: 방법 D에서 니트로셀룰로오스 여과지의 박테리아는 나노 구조 표면의 관심 영역과 직접 접촉합니다. 이 방법은 박테리아 활성과 박테리아 배양에서 벌크 샘플 분해의 간섭을 최소화합니다. 나노표면 항균 활성을 조사하기 위해 Lin et al.16에 의해 기술된 프로토콜을 따른다.

  1. 2.2.1-2.2.2.1 단계의 절차에 따라 박테리아 파종 배양을 만듭니다. 2.4.2 단계에 따라 실제 시드 밀도를 확인하십시오.
  2. 샘플을 정사각형 모양으로 1 × 1 cm2 크기로 준비합니다. 모든 샘플 유형을 세 번 준비합니다. 필요한 경우 직경 15mm, 높이 10mm의 3차원(3D) 홀더에 샘플을 놓습니다. 샘플과 홀더를 조직 배양되지 않은 폴리스티렌 웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
  3. 멸균 된 니트로 셀룰로오스 종이를 직경 1cm로 트리밍하여 준비하십시오. 준비된 니트로셀룰로오스 종이를 적절한 배지가 들어 있는 한천 플레이트에 놓습니다.
  4. 희석된 세균 배양액 50 μL를 여과지 상에 피펫한다.
  5. 적절한 배지 50μL를 각 샘플 표면의 중앙에 피펫합니다.
  6. 멸균 된 핀셋을 사용하여 한천 표면에서 니트로 셀룰로오스 종이를 집어 올리십시오. 니트로셀룰로오스 종이를 조심스럽게 뒤집어 샘플 표면에 놓아 박테리아가 50μL의 배지 및 관심 있는 나노 구조 표면과 접촉하도록 합니다.
  7. 습도를 유지하기 위해 샘플이 들어 있는 각 웰에 1mL의 Tris 완충액을 추가합니다. 모든 샘플을 함유하는 폴리스티렌 웰 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
  8. 각 샘플 표면에서 니트로셀룰로오스 종이를 수집합니다. 각각 5mL의 트리스 완충액에 넣습니다. 수집된 여과지와 나노표면 재료 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다.
  9. 각 샘플을 10 분 동안 초음파 처리합니다. 5분 후 5초 동안 소용돌이치고 10분 후에 다시 소용돌이칩니다.
  10. 모든 샘플에서 트리스 버퍼 현탁액을 수집하고 각 부피를 개별 신선한 수집 튜브에 넣습니다.
  11. 2.6.2-2.6.6 단계에 따라 샘플을 연속적으로 희석하고 플레이트합니다.

6. 박테리아 및 나노 물질의 배양 후 특성 분석

  1. 주사전자현미경(SEM)을 이용한 박테리아 접착 및 형태 검사
    1. 하룻밤 배양 후, 샘플이 완전히 덮일 때까지 48 웰, 비 조직 처리 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 10 % 글루 타르 알데히드를 첨가합니다. 박테리아 세포를 고정하기 위해 샘플을 1시간 동안 배양합니다.
    2. 글루타르알데히드를 폐기물 병에 흡인하고 모든 샘플을 트리스 완충액으로 3배 헹구어 비부착성 박테리아를 제거합니다.
    3. 30%, 75% 및 100% 에탄올을 사용하여 각각 30분 동안 샘플을 탈수합니다16.
      알림: 임계점 건조기를 사용하여 s를 건조하는 것이 좋습니다.amp르. 샘플을 실온에서 24시간 동안 자연 건조하는 것은 이상적이지 않습니다.
    4. 구리 또는 탄소 테이프와 같은 전도성 접착 테이프를 사용하여 샘플을 SEM 스텁에 고정합니다. 이미징 전에 전도성을 제공하기 위해 스퍼터 코팅을 통해 샘플 표면을 코팅합니다(예: 20mA에서 45초 동안 백금/팔라듐(Pt/Pd) 아래에 부착된 박테리아가 있는 Mg 플레이트코팅16).
      참고: 코팅 재료, 처리 시간 및 작동 전류는 샘플 유형에 따라 다를 수 있습니다.
    5. SEM을 사용하여 적절한 작동 거리와 가속 전압과 원하는 배율로 샘플의 박테리아 이미지를 촬영합니다. 예를 들어, 2차 전자 검출기가 있는 SEM을 사용하여 5mm의 작동 거리와 10kV의 가속 전압에서 이미지를 촬영합니다(16).
  2. SEM을 사용하여 배양 후 나노물질 샘플의 표면 형태를 검사합니다.
    1. 나노 물질의 경우 Tris 버퍼 3x를 사용하여 샘플을 세척하여 샘플에 부착되지 않은 유리 박테리아를 제거합니다. 나노 입자의 경우, 필요할 때 더 나은 분산을 달성하기 위해 초음파를 통해 샘플 특성에 영향을 미치지 않는 용매에 입자를 분산시킵니다.
    2. 세척 절차 후 샘플을 건조시킵니다.
    3. 탄소 또는 구리 양면 접착 테이프를 사용하여 샘플을 SEM 스브에 부착합니다.
    4. 이미징 전에 6.1.4단계에서 설명한 대로 스퍼터 코터를 사용하여 Pt/Pd의 전도성 표면층을 만듭니다. 6.1.5단계에 설명된 대로 샘플 이미지를 가져옵니다.
    5. 적절한 가속 전압과 원하는 배율로(예를 들어, SEM 분석을 수행한 후 10kV에서) EDS를 사용하여 표면 원소 조성을 분석합니다(예: SEM 분석 16을 수행한 후10kV에서).
  3. 박테리아 부착의 형광 이미징
    1. 형광 현미경을 사용하여 시각화할 샘플을 먼저 Tris 버퍼 3x로 세척하여 준비합니다. 샘플을 실온에서 자연 건조합니다.
    2. 확립된 프로토콜37에 따라 10μM 티오플라빈 T 형광 염료로 각 샘플을 염색합니다.
    3. 전자 증식 전하 결합 장치 디지털 카메라와 결합된 도립 현미경을 사용하여 박테리아 접착의 형광 이미징을 수행합니다.

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Representative Results

산화 마그네슘 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 식별은 다양한 재료 유형 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 사용하여 제시되었습니다.

방법 A와 방법 B는 지연 단계 (방법 A) 및 로그 단계 (방법 B)에서 24 시간 이상 나노 입자에 노출되었을 때 박테리아 활동을 검사합니다. 방법 A는 MIC 및 MBC에 관한 결과를 제공하는 반면, 방법 B는 나노 입자의 억제 대 살균 효과를 결정합니다. 방법 C는 나노 구조 표면과 직접 및 간접 접촉하여 박테리아 활동을 검사하고, 방법 D는 24 시간 이상의 기간 동안 세포-나노 구조 계면의 선택된 영역에서 박테리아 활동을 검사합니다.

사용된 방법은 그림 1과 그림 2에 설명되어 있으며 그 결과는 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7 및 그림 8에 나와 있습니다. 그람 음성균 및 그람 양성균 및 효모에 대한 nMgO의 항균 활성을 정량화한 대표적인 실험 결과는 도 3에서 볼 수 있다. MRSA에 대한 nMgO 및 nMg(OH)2의 항균 활성은 그림 4에서 볼 수 있습니다. MRSA에 대한 나노 구조 표면의 항균 활성은 그림 5와 그림 6에서 볼 수 있습니다. 마지막으로, 대장균에 대한 마그네슘 합금의 항균 활성은 도 8B에서 볼 수 있다.

방법 A를 사용하면 일관된 방법과 재료를 사용하여 나노 입자에 노출된 박테리아에 대한 MIC 및 MBC를 결정할 수 있습니다. 이러한 일관성을 통해 확인된 MBC를 사용하여 종 간에 비교하여 테스트된 나노 입자의 가장 강력한 농도를 결정할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 MICs 및 최소 치사 농도(MLCs17)의 비교를 위해 미생물의 다른 분류에도 적용될 수 있다. 여기서, 멸균 된 나노 입자는 필요한 각 농도의 3 배를 허용하는 양으로 사전 측정되었다. 이 나노 입자는 6 × 10 6-8 × 106 cells/mL의 밀도를 갖는 지연 상 단일 박테리아 파종 배양에 현탁되었습니다. 사전 측정된 나노입자를 파종 배양액 또는 브로스로 현탁시키는 방법은 나노입자 분포에서 상대적으로 상동성인 삼중 샘플을 성공적으로 생성했으며, 이는 삼중 샘플 내에서 CFU/mL의 편차를 줄일 수 있습니다. 이 방법에 대한 실험적 워크플로는 그림 1A에 나와 있습니다. 그람 음성균 및 그람 양성균과 칸디다 균에 대한 nMgO의 항균 효과에 대한 시연. 방법 A를 사용하는 것은 그림 3에서 볼 수 있습니다. 여기에서 그람 음성 대장균 및 녹농균에 대한 1.0mg/mL nMgO의 MIC와 각각 1.0mg/mL 및 1.6mg/mL nMgO의 MBC 99.99가 이들 종에 대해 확인되었습니다(그림 3A). 그람 양성 S. epidermidis, S. aureus 및 MRSA는 각각 0.5mg/mL, 0.7mg/mL 및 1.0mg/mL nMgO의 MIC를 나타냈습니다. 1.6mg/mL 및 1.2mg/mL nMgO의 MBC 99.99 값은 각각 S. epidermidis와 S. aureus에서 확인되었지만 MRSA는 MBC90 이상으로 감소하지 않았습니다(그림 3B). 약물 민감성 및 약물 내성 칸디다 종, C. albicans 및 C. albicans FR에서 각각 1.2mg/mL 및 1.0mg/mL nMgO의 MIC가 확인되었습니다. 대조적으로, nMgO는 C. glabrata 및 C. glabrata ER에 대해 각각 1.0 및 0.7 mg/mL의 MIC 값을 나타냈다. 또한, 각 칸디다 종은 0.7-1.2 mg/mL nMgO의 MBC 90에 도달했지만, C.glabrata ER만이 1.2 mg/mL nMgO에서 MBC 99.99로 감소했습니다(그림 3C). 또한, 시험 된 대부분의 종에서, nMgO의 가장 강력한 농도 (MPC)의 확인이 결정되었다. MPC는 폴리-미생물 군집(poly-microbial community)에 걸쳐 가장 효과적인 나노입자 농도를 나타낸다(17).

방법 B는 방법 A에서 확인된 MBC를 사용하여 나노입자가 정균(억제성)인지 살균성인지 결정하기 위해 로그 성장 단계의 박테리아를 특정 농도의 나노입자에 노출시킵니다. 이 방법은 나노 입자 노출에 대한 반응으로 박테리아 성장의 변화를 식별하기 위해 개별 기간 동안 분광 광도법(OD600) 측정을 사용합니다. 또한, 정균 또는 살균성 항생제에 노출된 박테리아는 이러한 나노입자 활성의 식별에 대한 참조를 제공하기 위해 별도의 웰에서 나노입자에 노출된 박테리아와 동시에 성장합니다. 사용된 nMgO 및 nMg(OH)2의 농도는 nMgO 및 nMg(OH)2에 노출된 대수 성장 단계의 박테리아를 사용한 이전 연구에서 파생되었습니다. nMgO 및 nMg(OH)2의 농도는 5mM 내지 50mM 범위의 mM 등가물을 사용하여 확인되었다. 결과는 nMgO가 30mM(1.2mg/mL nMgO)에서 MRSA에 살균되는 반면 nMg(OH)2는 50mM(2.9mg/mL nMg(OH)2)에서 정균성임을 보여주었습니다. 사용 된 항생제의 농도는 문헌에서 확인되었으며 자체 실험에서 확인되었습니다. 이 방법에 대한 실험적 워크플로는 그림 1B에 나와 있습니다. 방법 B에 대한 대표적인 결과는 그림 4에서 볼 수 있습니다. 여기서, 나노 입자에 노출되지 않은 MRSA는 0.85의OD600으로 기하 급수적으로 증가했다. 1.2 mg/mL nMgO 및 6.25 μg/mL 트리메토프림에 노출되었을 때, 박테리아 성장은 0.18(각각 80.2% 및 81.6%)의 OD 600으로 감소되었고, 2.9 mg/mL nMg(OH)2는 박테리아 성장을 0.25(70.3%)의 OD600으로 감소시켰습니다. 1.0μl/mL 반코마이신에 노출되면 MRSA의 성장이 99.99% 감소했으며, 이는 여기에 사용된 nMgO 및 nMg(OH)2의 농도가 활성이 정균임을 시사합니다.

방법 C는 나노 구조 표면의 항균 활성을 조사합니다. 지연 단계 성장의 박테리아 배양을 나노 구조 표면에 직접 시딩하여 표면과 직접 접촉하거나 접촉하지 않고 CFU를 측정했습니다. 이 방법을 사용하여 직접 접촉 조건에서 박테리아 부착 및 생존력에 대한 표면 효과를 결정할 수 있었습니다. 나노 구조 표면과 직접 접촉하고 간접 접촉(배양 현탁액)에 있는 박테리아를 수집 및 CFU/mL로 정량화하여 각 조건에서 박테리아 성장을 결정했습니다. 얻어진 이러한 데이터는 표면 구조에 대한 박테리아 집락화의 감소가 요구되는 임상 사용을 위해 표면에 나노 구조 물질의 다운스트림 적용에 유용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 실험적 워크플로는 그림 2A에 나와 있습니다. 방법 C에 대한 대표적인 결과는 그림 5에서 볼 수 있습니다. 여기서, 간접 접촉에 의한 박테리아 성장의 억제는 없었다. 그러나 박테리아 접착력은 모든 기판에서 감소했으며, ZC21 합금에서 가장 크게 감소했으며 T64(티타늄), 마그네슘, 유리만 및 ZSr41 합금이 그 뒤를 이었습니다. 이러한 결과는 ZC21이 시험된 모든 샘플에 대해 MRSA의 부착 및 성장에 대해 가장 강력한 항균 활성을 가졌음을 나타낸다14.

방법 D는 여과지에 박테리아를 나노 구조 표면에 직접 배치하여 세포-나노 구조 계면에서 선택된 관심 영역에서 항균 활성을 검사합니다. 이 방법을 사용하여, 항균 활성과 표면 특성 사이의 상관관계, 예컨대 표면 화학, 거칠기 및 나노구조 표면의 면적을 확인할 수 있다16. 이 방법에 대한 실험적 워크플로는 그림 2B에 나와 있습니다. 방법 D에 대한 대표적인 결과는 그림 6에서 볼 수 있습니다. 여기에서 1.9A, 1.9 AA 및 EPD 샘플 또는 한 쌍의 여과지에서 생존 가능한 S. 아우레우스 가 확인되지 않았습니다. 그러나, 어닐링 후 EPD 샘플에 대한 노출 (A-EPD)은 나노 구조 표면과 쌍을 이루는 여과지 상의 몇 개의 세포로의 박테리아 성장을 감소시켰다. 마그네슘 (Mg)을 함유 한 샘플도 박테리아 성장이 없었지만 한 쌍의 여과지에서 생존 가능한 박테리아를 분리했습니다. S. 아우레우스 의 성장 감소는 티타늄과 유리 샘플 또는 한 쌍의 여과지에서는 나타나지 않았다16.

항균 활성을 결정하기 위해 위에서 설명한 방법을 사용하는 것 외에도 SEM 및 형광 현미경을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 물질에 노출된 후 미생물에서 발생하는 형태학적 변화를 특성화할 수 있습니다. 노출 후 그람 음성 대장균을 보여주는 대표적인 SEM 이미지는 그림 7A에 제시되어 있고, 노출 후 그람 양성 S. 아우레우스를 보여주는 것은 그림 7B에 제시되어 있습니다. 5,000x 배율의 SEM 이미징 기술을 사용하여 0.5 mg/mL nMgO 이상의 농도에 노출된 대장균의 표현형 변화를 확인할 수 있었다17. 형광 현미경은 미생물의 형태학적 변화를 특성화하는 데에도 사용할 수 있지만 SEM보다 잠재적으로 비용이 저렴하고 접근성이 뛰어납니다. 도 8은 1일, 2일, 3일 동안 나노구조 물질에 MgY_O 노출된 대장균의 대표적인 형광 이미지뿐만 아니라 참조 대장균을 보여준다. 처음에는 단 하나의 박테리아 종인 대장균(E. coli)만 사용되었습니다. 앞으로 우리는 MgY_O 노출에 대한 박테리아 반응에 대한 보다 포괄적인 이해를 생성하기 위해 동일한 관심 물질에 추가 박테리아 종을 노출시키는 것을 고려할 것입니다. 이러한 결과에서, MgY_O15의 항균 활성의 정성 분석을 위해 티오플라빈 T 염색 및 형광 현미경을 사용하여 개별 대장균 세포 및 콜로니를 관찰하고 이미지화할 수 있었습니다.

Figure 1
그림 1: 나노입자 MIC 또는 MBC90-99.99 및 노출 후 세포 배양에서 정균 또는 살균 활성을 결정하기 위한 개략도 . (A) 직접 공동 배양 방법17. (B) 직접 노출 방법. 약어: CFU = 집락 형성 단위; NPs= 나노입자; OD600 = 600 nm에서의 광학 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 직접 및 간접 접촉과 나노 구조 표면의 세포-나노 구조 계면에서 박테리아 성장을 결정하기 위한 개략도. (A) 직접 배양 방법14. (B) 초점 접촉 노출 방법16. 약어: CFU = 집락 형성 단위; SEM = 주사 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 0-2.0 mg/mL nMgO에 노출된 후 24시간 후에 CFU/mL로 정량화된 생존 가능한 박테리아 및 효모의 표현. (A) 대장균 및 녹농 균을 포함한 그람 음성 박테리아의 CFU/mL.(B) S. epidermidis, S. aureus 및 methicillin-resistant S. aureus를 포함한 그람 양성균의 CFU/mL. (C) 약물 감수성 C. 알비칸스, 약물 내성 C. 알비칸스 FR, 약물 감수성 C. 글라브라타 및 약물 내성 C. 글라브라타 ER 의 CFU/mL.데이터는 평균 ± 표준 편차(N=9)로 표시됩니다. *p≤ 0.05로, 각 박테리아 또는 효모에 대해 0-0.7 mg/mL nMgO로 그룹보다 현저히 낮습니다. ^p ≤ 0.05로 각 미생물에 대해 0-1 mg/mL nMgO에서 그룹보다 현저히 낮습니다. #p≤ 0.05로 각 미생물에 대해 0-0.5 mg/mL nMgO에서 그룹보다 현저히 낮습니다. &p ≤ 0.05로, 각 미생물에 대해 0-0.3 mg/mL nMgO로 그룹보다 현저히 낮았다17. 이 그림은 Nguyen et al.17에서 수정되었습니다. 약어: FR = 플루코나졸 내성; ER = 에키노칸딘 내성; nMgO = 산화마그네슘 나노입자; CFU = 집락 형성 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 메티실린 내성 S. 아우레우스에 대해 실시간으로 측정한 광학 밀도 판독값(OD600)의 표현. 24시간 동안 1.2mg/mL nMgO, 2.9mg/mL nMg(OH)2, 6.25μg/mL 트리메토프림 및 1.0μg/mL 반코마이신에 대한 MRSA 노출. p ≤ 0.025: 0.5시간에 1.0μg/mL 반코마이신에 노출된 MRSA의 성장은 7.5시간에 2.9mg/mL Mg(OH)2에 노출된 MRSA의 성장보다 현저히 낮습니다. ^p ≤ 0.025: 접종 후 24시간에 1.0μg/mL 반코마이신에 노출된 MRSA의 성장은 24시간에 2.9mg/mL Mg(OH)2에 노출된 MRSA의 성장보다 현저히 낮습니다. 데이터는 평균± 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 시료 및 대조군에 노출된 후 24시간에 CFU/mL로 정량화된 생존 가능한 메티실린 내성 S. 아우레우스 의 표현. 박테리아는 7.5 × 105 cells/mL의 실제 밀도로 파종되었고 CFU/mL로 확인되었습니다. 데이터는 평균± 표준편차, n=3으로 표시되고; *p < 0.05입니다. Equation 1p < ZC21 샘플의 CFU와 비교할 때 0.05입니다. 이 수치는 Zhang et al.14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 표면 처리된 Mg 샘플에 노출된 후 24시간 후 박테리아 파종 밀도의 CFU/mL에 의한 대표 정량화amp1.9 A, 1.9 AA, EPD 및 A-EPD, Mg 및 Ti 대조군 샘플. 박테리아는 빨간색 점선으로 표시된 6 ×10 6 CFU/mL의 실제 밀도로 파종되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. n = 3입니다. *p < 0.05. 검은색 실선은 시료 표면의 박테리아 밀도에 대한 통계 분석 결과를 나타냅니다. 파란색 점선은 샘플 표면을 덮고 있는 필터의 박테리아 밀도에 대한 통계 분석 결과를 나타냅니다. 약어: CFU = 집락 형성 단위; A-EPD = 어닐링 후 전기영동 증착; EPD = 어닐링 전 전기영동 증착; A = 어닐링 전 아노다이징; AA = 어닐링 후 아노다이징. 이 수치는 Lin et al.16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 0-1.2 mg/mL nMgO 에 노출된 그람 음성 대장균 및 그람 양성 황색포도상구균의 대표적인 SEM 이미지. (A) 대장균 은 1.2mg/mL에서 2.0mg/mL nMgO로 유사한 형태를 보였다. 이러한 이유로 1.2mg/mL의 한 이미지는 더 높은 nMgO 농도에 노출된 대장균을 대표하는 것으로 표시됩니다. (B) S. 아우레우스는 또한 1.2 mg/mL 내지 2.0 mg/mL nMgO에서 유사한 형태를 보였다. 이러한 이유로, 1.2 mg/mL의 한 이미지는 더 높은 nMgO 농도에 노출된 S. 아우레우스를 나타내는 것으로 나타난다17. 스케일 바 = 5 μm. nMgO = 산화 마그네슘 나노 입자. 이 수치는 Nguyen et al.17에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 배양 1일, 2일 및 3일에서 정량화하여 기질에 부착된 대장균의 대표적인 형광 이미지. (A) 10μM 티오플라빈 T로 염색된 대장균의 형광 이미지. (B) cells/mL를 사용하여 관심 물질에 노출된 대장균의 정량화. 배양 2일 후 MgY_O에 대한 박테리아 부착은 없었고, 배양 3일 후에는 MgY에 대한 순응도가 감소했습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 수치는 Lock et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 특성화하기 위해 4 가지 시험관 내 방법 (AD)을 제시했습니다. 이러한 각 방법은 나노 물질에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 박테리아 성장 및 생존력을 정량화하지만 시간 경과에 따른 초기 박테리아 파종 밀도, 성장 및 생존력을 측정하는 데 사용되는 방법에는 약간의 차이가 있습니다. 이 방법 중 세 가지, 직접 공동 배양 방법 (A) 17, 직접 배양 방법 (C) 14 및 초점 접촉 노출 방법 (D) 16은 단위 부피당 CFU를 계산하여 나노 물질에 노출 된 후 박테리아 성장과 생존력을 정량화합니다. 이에 비해 직접 노출 방법(B)은 이산 실시간 광학 밀도(OD600) 측정을 통해 박테리아 성장을 정량화합니다. 이 방법은 CFU를 정량화하는 데 시간 제약이 있거나 동역학 연구에 실시간 박테리아 밀도 판독이 필요한 경우 직접 공동 배양, 직접 배양 및 집중 접촉 노출 방법에도 적용할 수 있습니다. 직접 노출 방법으로 테스트 할 박테리아 종에 대해 효과적인 항생제가 알려지지 않은 경우, 나노 물질 그룹에 대한 참고 자료로 사용할 올바른 항생제와 MIC 값을 결정하기 위해 문헌 검색을 수행해야합니다. MIC 값의 확인은 분광 광도계 데이터와 특정 시점에서 집락 형성 단위의 정량화 사이의 관계를 플롯하는 표준화 곡선을 완성하여 수행할 수 있습니다. 이 과정은 특정 지점에서 배양에 존재하는 세포의 수를 각각의 광학 밀도와 연관시킵니다. 또한, 지연 단계 성장의 박테리아는 직접 공동 배양 방법에서 나노 입자에 도입되고 직접 배양 및 집중 접촉 노출 방법에서 나노 구조 표면에 도입됩니다. 대조적으로, 대수 성장 단계의 박테리아는 직접 노출 방법으로 나노 입자에 도입됩니다. 또한 박테리아 파종 밀도는 직접 공동 배양 방법, 직접 배양 방법 및 집중 접촉 노출 방법에서 cells/mL로 정량화되는 반면, 박테리아의 광학 밀도(OD600)는 직접 노출 방법에서 실시간 성장을 추적하기 위해 측정됩니다.

이러한 각 방법은 프레임워크가 유사하지만 나노 입자 또는 나노 구조 표면이 박테리아에 미치는 영향을 구별하는 고유한 특성도 나타냅니다. 예를 들어, 직접 공동 배양 방법은 CFU/mL 정량을 통해 사전 측정된 나노입자 농도 증가에 대한 박테리아 반응을 특성화합니다(그림 3). 이 방법은 관심 미생물 종에 대한 나노 입자의 최소 억제 및 최소 살균 농도 (MIC 및 MBC)를 생성하고, 여러 종을 조사하는 경우 나노 입자의 가장 강력한 농도 (MPC)를 생성합니다17. MIC, MBC90-99.99 및 MPC의 식별은 다운스트림 응용 분야에서 나노 입자의 적용에 필수적입니다. 예를 들어, 이러한 데이터는 치사량 미만의 농도가 확인되었을 때 세포 적합성을 유지하면서 나노 입자 항균 활성의 생체 내 검사에 적용될 수 있습니다. 대조적으로, 직접 노출 방법은 항생제의 분류와 유사한 방식으로 나노 입자 활성을 정균 또는 살균으로 특성화하며, 여기서 시너지 효과 또는 바람직하지 않은 효과는 연구 또는 임상 환경에서 사용하기 전에 확인되어야합니다.

정균 또는 살균성으로서의 항균 화합물의 특성화는 임상 사용 및 시험관 내 및 생체 내 연구와 관련이 있다38. 이러한 이유로 이러한 특성을 조사하는 방법을 설계할 때 결과에 영향을 미칠 수 있는 부정적인 영향을 식별해야 합니다. 여기서 직접 노출 방법은 600nm에서 광학 밀도의 실시간 측정을 사용하여 특정 박테리아 종에 대해 나노 입자를 정균 또는 살균으로 분류합니다(그림 4). 대수 성장 단계의 박테리아는 MIC 수준에서 나노 입자와 혼합되어 박테리아 및 나노 입자 현탁액을 생성합니다. 이러한 현탁액은 박테리아에 대한 나노 입자 노출의 지속적인 영향을 결정하기 위해 실시간으로 신중하게 측정됩니다. 얻어진 결과를 검증하기 위해, 정균 및 살균성 항생제가 함유된 현탁액에서 동시에 성장한 박테리아가 나노입자에 노출된 박테리아의 성장률을 확인하는 기준이 됩니다.

나노 입자를 생명 공학, 임상 및 환경 과학에 통합하는 것은 광범위한 가능성을 가질 수 있지만 나노 구조 표면에 대한 시험관 내 및 생체 내 연구를 위해 나노 입자의 항균 데이터를 사용하는 것은 달성하기 어렵습니다. 이러한 이유로 우리는 나노구조 표면의 시험관 내 항균 활성을 특성화하기 위해 직접 배양 및 집중 접촉 노출 방법을 제시했습니다. 직접 배양 방법은 박테리아가 관심 물질과 직접 접촉할 때 나노구조 표면의 항균 효과를 조사한다14. 여기에서 rSBF와 10% FBS에 현탁된 박테리아를 나노 구조 표면에 노출시킨 다음 CFU/mL를 사용하여 표면과 직접 접촉하고 관심 물질을 둘러싼 현탁액(간접 접촉)에서 박테리아에 대한 시간 경과에 따른 박테리아 성장을 정량화합니다. 이전에 마그네슘 합금 나노 구조(ZC21 및 ZSr41 합금)와 관련된 실험 결과에서는 박테리아가 거의 또는 전혀 접촉하지 않고 부유 상태로 남아 있는 간접 접촉에 비해 박테리아가 나노 구조 표면과 직접 접촉할 때 항균 활성이 증가하는 것으로 나타났습니다14 (그림 5). 마지막으로, 집속 접촉 방법은 박테리아와 나노 구조 표면(16)의 계면에서의 항균 활성을 특성화한다. 여기에서 우리는 시간이 지남에 따라 박테리아 접착 및 생물막 형성의 잠재적인 파괴를 결정하기 위해 생체 흡수성 마그네슘 합금의 표면에 양극 산화 또는 전기 영동 증착된 산화마그네슘을 조사했습니다. 생물막은 숙주 면역 반응과 항생제 요법을 회피하는 경향이 있고39 치료하기 매우 어려운 감염을 초래하기 때문에 생물막 형성의 중단은 환자 치유 과정에 중요할 수 있다.

여기에서는 일본 산업 표준 JIS Z 2801:200016에서 채택한 방법을 제시합니다. 이 방법은 박테리아가 멸균 된 니트로 셀룰로오스 여과지에 부착 된 후 나노 구조 표면의 고정 된 영역에 노출되도록합니다. 이것은 항균 활성에 대한 표면 효과의 특성을 테스트 영역으로만 제한합니다. 대표적인 결과에서, 어닐링 전 아노다이징(1.9A), 어닐링 후 아노다이징(1.9AA) 및 어닐링 전 전기영동 증착(EPD) 샘플은 마그네슘, 티타늄 및 유리 대조군 샘플과 비교할 때 박테리아 성장 및 해당 여과지 감소에 상당한 영향을 미쳤습니다. 어닐링 후 전기영동 증착(A-EPD) 샘플도 박테리아 성장을 줄이는 데 효과적이었지만, 이 결과는 1.9A, 1.9AA 및 EPD 샘플16 에 대해 얻은 결과와 비교하여 덜 유의했습니다(그림 6).

요약하면, 여기에 제시된 각 시험관 내 방법은 합리적으로 마스터하기 쉽고 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 재료를 통합합니다. 이러한 방법은 연구자가 관심을 갖는 광범위한 나노 물질과 미생물 종 간의 상호 작용을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 간의 유사점과 차이점을 이해하는 것은 연구 목표를 달성하기 위한 최적의 실험을 설계하는 데 필요합니다. 여기에서 이러한 시험관 내 방법에서 얻은 과학적 지식은 항생제가 제한되어야 하거나 바람직하지 않은 접근 방식을 나타내야 하는 다운스트림 의료 응용 분야에 적용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 미국 국립 과학 재단 (NSF CBET 상 1512764 및 NSF PIRE 1545852), 국립 보건원 (NIH NIDCR 1R03DE028631), 캘리포니아 대학교 (UC) 리전트 교수 개발 펠로우쉽, 연구 종자 보조금위원회 (Huinan Liu) 및 Patricia Holt-Torres에게 수여 된 UC-Riverside 대학원 연구 멘토십 프로그램 보조금. 저자는 SEM/EDS 사용을 위해 UC-Riverside의 CFAMM(Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis)과 XRD 사용을 위해 Perry Cheung 박사가 제공한 지원에 감사드립니다. 저자는 또한 실험 및 데이터 분석에 도움을 준 Morgan Elizabeth Nator 및 Samhitha Tumkur에게 감사를 표합니다. 이 기사에 표현된 모든 의견, 발견, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 국립 과학 재단 또는 국립 보건원의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

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References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

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Bioengineering 항균 나노 입자 나노 구조 표면 최소 억제 농도 (MIC) 최소 살균 농도 (MBC) 용량 의존적 박테리아 박테리아
<em>시험관 내에서</em> 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가
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Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

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