Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Evaluering af antimikrobielle aktiviteter af nanopartikler og nanostrukturerede overflader in vitro

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

Vi introducerer fire metoder til at evaluere nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter ved hjælp af in vitro-teknikker . Disse metoder kan tilpasses til at studere interaktionerne mellem forskellige nanopartikler og nanostrukturerede overflader med en bred vifte af mikrobielle arter.

Abstract

De antimikrobielle aktiviteter af nanopartikler og nanostrukturerede overflader, såsom sølv, zinkoxid, titandioxid og magnesiumoxid, er tidligere blevet undersøgt i kliniske og miljømæssige omgivelser og i forbrugsvarer. Manglende konsistens i de anvendte forsøgsmetoder og materialer har imidlertid kulmineret i modstridende resultater, selv blandt undersøgelser af de samme nanostrukturtyper og bakteriearter. For forskere, der ønsker at anvende nanostrukturer som additiv eller belægning i et produktdesign, begrænser disse modstridende data deres udnyttelse i kliniske omgivelser.

For at konfrontere dette dilemma præsenterer vi i denne artikel fire forskellige metoder til at bestemme nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter og diskuterer deres anvendelighed i forskellige scenarier. Tilpasning af konsistente metoder forventes at føre til reproducerbare data, der kan sammenlignes på tværs af undersøgelser og implementeres for forskellige nanostrukturtyper og mikrobielle arter. Vi introducerer to metoder til at bestemme nanopartiklers antimikrobielle aktiviteter og to metoder til nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter.

For nanopartikler kan metoden med direkte samdyrkning anvendes til at bestemme de mindste hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer af nanopartikler, og dyrkningsmetoden med direkte eksponering kan anvendes til at vurdere bakteriostatisk versus bakteriedræbende aktivitet i realtid som følge af nanopartikeleksponering. For nanostrukturerede overflader anvendes metoden med direkte dyrkning til at bestemme levedygtigheden af bakterier, der indirekte og direkte er i kontakt med nanostrukturerede overflader, og metoden med fokuseret kontakteksponering anvendes til at undersøge antimikrobiel aktivitet på et bestemt område af en nanostruktureret overflade. Vi diskuterer vigtige eksperimentelle variabler, der skal overvejes til in vitro-undersøgelsesdesign , når de antimikrobielle egenskaber af nanopartikler og nanostrukturerede overflader bestemmes. Alle disse metoder er relativt billige, anvender teknikker, der er relativt lette at mestre og gentages for konsistens, og er anvendelige på en bred vifte af nanostrukturtyper og mikrobielle arter.

Introduction

I USA alene udvikler 1,7 millioner individer en hospitalserhvervet infektion (HAI) årligt, hvor en ud af hver 17 af disse infektioner resulterer i død1. Derudover anslås det, at behandlingsomkostningerne for HAI'er varierer fra $ 28 milliarder til $ 45 milliarder årligt 1,2. Disse HAI'er domineres af methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 og Pseudomonas aeruginosa4, som almindeligvis isoleres fra kroniske sårinfektioner og normalt kræver omfattende behandling og tid for at producere et gunstigt patientresultat.

I løbet af de sidste årtier er der udviklet flere antibiotikaklasser til behandling af infektioner relateret til disse og andre patogene bakterier. For eksempel er rifamycinanaloger blevet anvendt til behandling af MRSA, andre gram-positive og gram-negative infektioner og Mycobacterium spp. infektioner5. I 1990'erne, for effektivt at behandle et stigende antal M. tuberculosis-infektioner, blev yderligere lægemidler kombineret med rifamycinanaloger for at øge deres effektivitet. Imidlertid forbliver ca. 5% af M. tuberculosis-tilfældene resistente over forrifampicin5,6, og der er stigende bekymring for multiresistente bakterier7. I øjeblikket er brugen af antibiotika alene muligvis ikke tilstrækkelig til behandling af infektioner erhvervet i sundhedsvæsenet, og dette har fremkaldt en løbende søgning efter alternative antimikrobielle behandlingsformer1.

Tungmetaller, såsom sølv (Ag)8,9,10 og guld (Au)11, og keramik, såsom titandioxid (TiO 2)12 og zinkoxid (ZnO)13, i nanopartikel (NP) form (henholdsvis AgNP, AuNP, TiO2 NP og ZnONP) er blevetundersøgt for deres antimikrobielle aktiviteter og er blevet identificeret som potentielle antibiotikaalternativer. Derudover bioresorberbare materialer, såsom magnesiumlegeringer (Mg-legeringer)14,15,16, magnesiumoxidnanopartikler 17,18,19,20,21 og magnesiumhydroxidnanopartikler [henholdsvis nMgO og nMg(OH)2]22,23,24, er også blevet undersøgt. De tidligere antimikrobielle undersøgelser af nanopartikler anvendte imidlertid inkonsekvente materialer og forskningsmetoder, hvilket resulterede i data, der er vanskelige eller umulige at sammenligne og undertiden er modstridende i naturen18,19. For eksempel varierede den mindste hæmmende koncentration (MIC) og den minimale bakteriedræbende koncentration (MBC) af sølvnanopartikler signifikant i forskellige undersøgelser. Ipe et al.25 evaluerede de antibakterielle aktiviteter af AgNP'er med en gennemsnitlig partikelstørrelse på ~ 26 nm for at bestemme MIC'erne mod gram-positive og gram-negative bakterier. De identificerede MIC for P. aeruginosa, E. coli, S. aureus og MRSA var henholdsvis 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml og 10 μg/ml. I modsætning hertil evaluerede Parvekar et al.26 AgNP'er med en gennemsnitlig partikelstørrelse på 5 nm. I dette tilfælde viste AgNP MIC og en MBC på 0,625 mg / ml sig at være effektive mod S. aureus. Derudover evaluerede Loo et al.27 AgNP'er med en størrelse på 4,06 nm. Når E. coli blev eksponeret for disse nanopartikler, blev MIC og MBC rapporteret ved 7,8 μg/ml. Endelig undersøgte Ali et al.28 de antibakterielle egenskaber af sfæriske AgNP'er med en gennemsnitlig størrelse på 18 nm. Når P. aeruginosa, E. coli og MRSA blev udsat for disse nanopartikler, blev MIC identificeret ved henholdsvis 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml og 36 μg / ml, og MBC blev identificeret ved henholdsvis 36 μg / ml, 42 μg / ml og 30 μg / ml.

Selvom nanopartiklers antibakterielle aktivitet er blevet grundigt undersøgt og rapporteret i de seneste årtier, er der ingen standard for de materialer og forskningsmetoder, der anvendes til at muliggøre direkte sammenligninger på tværs af undersøgelser. Af denne grund præsenterer vi to metoder, den direkte samkulturmetode (metode A) og den direkte eksponeringsmetode (metode B), til at karakterisere og sammenligne nanopartiklers antimikrobielle aktiviteter, samtidig med at materialerne og metoderne holdes konsistente.

Ud over nanopartikler er nanostrukturerede overflader også blevet undersøgt for antibakterielle aktiviteter. Disse omfatter kulstofbaserede materialer, såsom grafennanoark, kulstofnanorør og grafit29 samt rene Mg- og Mg-legeringer. Hvert af disse materialer har udvist mindst en antibakteriel mekanisme, herunder fysisk skade på cellemembraner af kulstofbaserede materialer og skade på metaboliske processer eller DNA gennem frigivelse af reaktive iltarter (ROS), når Mg nedbrydes. Når zink (Zn) og calcium (Ca) kombineres i dannelsen af Mg-legeringer, forbedres forfiningen af Mg-matrixkornstørrelsen, hvilket fører til en reduktion i bakteriel vedhæftning til substratoverflader sammenlignet med Mg-only-prøver14. For at demonstrere antibakteriel aktivitet præsenterer vi den direkte kulturmetode (metode C), som bestemmer bakteriel vedhæftning på og omkring nanostrukturerede materialer over tid gennem kvantificering af bakteriekolonidannende enheder (CFU'er) med direkte og indirekte overfladekontakt.

Nanostrukturernes geometri på overflader, herunder størrelse, form og orientering, kan påvirke materialernes bakteriedræbende aktiviteter. For eksempel fremstillede Lin et al.16 forskellige nanostrukturerede MgO-lag på overfladerne af Mg-substrater gennem anodisering og elektroforetisk aflejring (EPD). Efter en periode med eksponering for den nanostrukturerede overflade in vitro blev væksten af S. aureus væsentligt reduceret sammenlignet med ubehandlet Mg. Dette indikerede en større styrke af den nanostrukturerede overflade mod bakteriel vedhæftning versus den ubehandlede metalliske Mg-overflade. For at afsløre de forskellige mekanismer for de antibakterielle egenskaber ved forskellige nanostrukturerede overflader diskuteres en fokuseret kontakteksponeringsmetode (metode D), der bestemmer celle-overfladeinteraktionerne inden for interesseområdet, i denne artikel.

Formålet med denne artikel er at præsentere fire in vitro-metoder, der kan anvendes på forskellige nanopartikler, nanostrukturerede overflader og mikrobielle arter. Vi diskuterer vigtige overvejelser for hver metode for at producere konsistente, reproducerbare data til sammenlignelighed. Specifikt anvendes metoden med direkte samkultur17 og metoden med direkte eksponering til undersøgelse af nanopartiklers antimikrobielle egenskaber. Gennem den direkte co-kulturmetode kan de mindste hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer (henholdsvis MIC og MBC90-99,99) bestemmes for individuelle arter, og den mest potente koncentration (MPC) kan bestemmes for flere arter. Gennem metoden med direkte eksponering kan nanopartiklers bakteriostatiske eller bakteriedræbende virkninger ved minimale hæmmende koncentrationer karakteriseres ved realtidsaflæsninger af optisk densitet over tid. Direct Culture14-metoden er velegnet til at undersøge bakterier direkte og indirekte i kontakt med nanostrukturerede overflader. Endelig præsenteres metoden med fokuseret kontakteksponering16 for at undersøge den antibakterielle aktivitet af et specifikt område på en nanostruktureret overflade gennem direkte anvendelse af bakterier og karakterisering af bakterievækst ved celle-nanostrukturgrænsefladen. Denne metode er modificeret fra den japanske industristandard JIS Z 2801:200016 og har til formål at fokusere på mikrobe-overfladeinteraktioner og udelukke virkningerne af nedbrydning af bulkprøver i mikrobiel kultur på antimikrobielle aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For at præsentere metoderne til direkte samkultur og direkte eksponering bruger vi magnesiumoxidnanopartikler (nMgO) som modelmateriale til at demonstrere bakterielle interaktioner. For at præsentere den direkte kultur og fokuserede kontakteksponeringsmetoder bruger vi en Mg-legering med nanostrukturerede overflader som eksempler.

1. Sterilisering af nanomaterialer

BEMÆRK: Alle nanomaterialer skal steriliseres eller desinficeres inden mikrobiel kultur. De metoder, der kan anvendes, omfatter varme, tryk, stråling og desinfektionsmidler, men materialernes tolerance for hver metode skal identificeres inden in vitro-forsøgene .

  1. Nanopartikler
    BEMÆRK: Prøver kan opbevares i et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, eller pakkes i en skål eller kasse efterfulgt af sterilisering eller desinfektion på en passende måde. Nanopartiklerne blev steriliseret ved hjælp af følgende metode til demonstration af den direkte samkulturmetode17 og metoden med direkte eksponering.
    1. Steriliser MgO-nanopartikler i en 200 °C konvektionsovn30 i 60 minutter før hvert in vitro-forsøg .
      BEMÆRK: Denne metode blev valgt, fordi vanddamp og UV-lys kan påvirke strukturerne af MgO-nanopartiklerne (nMgO)17.
  2. Bulk materialer
    BEMÆRK: De nanostrukturerede materialer blev steriliseret ved følgende metode til demonstration af den direkte kulturmetode.
    1. For direkte dyrkningsmetode14 desinficeres As-prepared ZC21-, Mg- og T64-prøver med ultraviolet (UV) stråling i 4 timer, før in vitro-undersøgelserne påbegyndes.
    2. For så vidt angår fokuskontakteksponeringsmetode16 desinficeres alle prøver med UV-stråling i 2 timer, før in vitro-undersøgelserne påbegyndes.
  3. Alternativt kan du bruge ethylenoxid (EtO) til sterilisering af varmefølsomme materialer.

2. Direkte samkulturmetode (metode A)

BEMÆRK: I metode A blandes bakterier i en lag-fase såkultur direkte med nanopartikler med visse koncentrationer. Til undersøgelse af nanopartikelantimikrobielle aktiviteter følger vi en protokol beskrevet af Nguyen et al.17.

  1. Karakterisering af nanopartikler og nanostrukturer
    BEMÆRK: Nanostruktursammensætning og form bekræftes ved hjælp af røntgenpulverdiffraktion.
    1. Måling af nanopartikler
      1. Nanopartiklerne vejes ved 9x den ønskede masse pr. ml for at rumme 3 ml prøver i tre eksemplarer. For eksempel vejer 0,2 mg / ml nMgO ved 1,8 mg / ml.
        BEMÆRK: Dette sikrer en ensartet fordeling af nanopartikler i bakteriekulturer og bouillon.
      2. Mål alle nanopartiklerne i et 5,0 ml mikrocentrifugerør, der er blevet forvejet og tjæret ved hjælp af en analytisk vægt.
  2. Forberedelse og dyrkning af bakteriekulturer
    1. For hvert in vitro-forsøg udtages bakteriecellestammer fra opbevaring ved -80 °C. Der tilsættes 10 μL af hver bakteriecellestamme i 5 ml af et passende vækstmedium.
    2. Det podede substrat anbringes i en inkubatorryster ved 37 °C og 250 o/min i ca. 16 timer natten over.
      1. Hvis der dyrkes Staphylococcus-arter , subkultur ved at anbringe 400 μL af hver natkultur i 20 ml frisk vækstmedium (100 μL/5 ml medium) og inkuberes med omrystning ved 37 °C og 250 rpm i yderligere 4-6 timer.
  3. Vask og tælling af bakteriecellerne for at bestemme såtætheden
    BEMÆRK: Den ønskede såtæthed på 7,8 × 106 CFU / ml blev identificeret som celletallet større end hvad der kræves for at bekræfte en urinvejsinfektion.
    1. Opsaml dyrkede bakterier ved at aliquotere 1 ml af bakteriekulturen natten over i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Opret et tilstrækkeligt antal alikvoter fra bakteriekulturer natten over og centrifuger dem i 10 minutter ved 1.956 × g for at nå de ønskede såtætheder.
    2. Efter centrifugeringen afpipetteres supernatanten fra de pelleterede celler og supernatanten anbringes i en opsamlingsbeholder. Resuspender cellepillerne i 0,5 ml frisk vækstmedium. Kombiner to 0,5 ml suspensioner for at skabe 1 ml suspension for at reducere antallet af 1 ml alikvoter af resuspenderede celler til seks. Gentag centrifugeringen i 10 minutter ved 1.956 × g.
    3. Et andet vaskeprogram gennemføres med frisk vækstmedium, som i trin 2.3.2, for at reducere antallet af 1 ml alikvoter af resuspenderede vaskede celler til tre.
    4. Den tredje cyklus fuldføres, som i trin 2.3.2, bortset fra at cellepellets resuspenderes i 0,33 ml Tris-buffer (hydroxymethyl)aminomethanbuffer (Tris-buffer, pH 8,5). Kombiner de tre suspensioner, hver med et volumen på 0,33 ml, til en 1,5 ml mikrocentrifuge. Gentag centrifugeringen i 10 minutter ved 1.956 × g.
      BEMÆRK: Tris-buffer indeholder ikke Mg 2+ eller Ca2+ ioner31. Dette er vigtigt for brugen af induktivt koblet plasmaoptisk emissionsspektrometri (ICP-OES) til måling af Mg 2+ og Ca2+ ioner i bouillon efter kultur. I modsætning hertil binder de fosfater, der er til stede i fosfatbufret saltvand (PBS)32, f.eks. både Mg 2+ eller Ca2+ ioner33,34,35 og skaber forvirring i fortolkningen af ICP-OES-dataene.
    5. Supernatanten fjernes fra de pelleterede celler. Resuspender cellepillen i 1 ml frisk Tris-buffer, kendt som cellesuspension-en lag-fase bakteriel såkultur.
    6. Bestem cellesuspensionskoncentrationen (celler / ml) ved hjælp af et hæmocytometer.
  4. Oprettelse af såningsbakteriekulturen
    BEMÆRK: Prøven har et samlet volumen på 3 ml og udfyldes i tre eksemplarer (9 ml i alt).
    1. Bestem den samlede mængde bakteriesåningskultur, der er nødvendig. For at skabe såkulturen skal du brugeC 1 V1 = C 2 V2til at beregne volumenet af cellesuspensionen, der er nødvendig for at skabe en såkultur på 7,8 × 106 celler / ml. Det beregnede volumen af cellesuspensionen (V1) tilsættes til det krævede volumen vækstmedie (V2).
    2. Bestem den faktiske bakteriesåningstæthed i CFU / ml. Opret en ti gange seriel fortynding til 10-4. Spredeplade 10-4 fortyndingen på den passende vækst agar og inkuberes natten over. Efter inkubation tælles antallet af kolonier, og CFU / ml beregnes.
  5. Dannelse af bakterier og nanopartikelkulturer
    1. I 12-brønds, ikke-vævsbehandlede polystyrenplader, alikvote 2 ml bakteriesåningskultur i hver brønd for det nødvendige antal brønde.
    2. For hvert 5 ml mikrocentrifugeglas, der indeholder forvejet nMgO, tilsættes 3 ml bakteriesåningskultur. Vortex kort for at blande nMgO med bakterierne. Alikvote 1 ml af blandingen i tre separate huller for at skabe de tredobbelte prøver af hver forudmålt vægt af nMgO. Pipetten bakterie/nMgO-blandingen 2-3x før hver 1 ml alikvote fremstilles for at opretholde nMgO i suspension.
      BEMÆRK: Kontrolprøver vil kun bestå af 3 ml celler, kun 3 ml medier og 3 ml indeholdende de laveste og højeste koncentrationer af anvendte nanopartikler. Disse udarbejdes som i trin 2.5.2. Alle kontrolprøverne udfyldes i tre eksemplarer.
    3. Alle pladerne med 12 huller inkuberes ved 37 °C og 120 o/min i 24 timer.
  6. Bestemmelse af bakteriecellevækst efter eksponering for nMgO
    1. Efter inkubation natten over af bakteriekulturerne opsamles hver 3 ml prøve ved pipettering i et individuelt 15 ml konisk rør.
    2. Brug en plade med 96 brønde til at skabe 1:10 serielle fortyndinger. Bestem antallet af kolonner, der er nødvendige for serielt at fortynde alle prøver, der indeholder bakterier. Der tilsættes 180 μL Tris-buffer til hvert hul i række B til række G for det relevante antal kolonner.
    3. Kort hvirvel hvert 15 ml konisk rør indeholdende bakterieprøver, og tilsæt 50 μL til en individuel brønd i række A.
    4. For hvert hul i række A overføres 20 μL til række B (f.eks. A1 til B1), og der blandes kort ved pipettering for at opnå et volumen på 200 μL. Ved hjælp af en steril pipetspids overføres 20 μL fra brønden i række B til brønden i række C. Dette mønster fortsættes, indtil brønden i række G indeholder 200 μL. fuldførelse af en seriel fortynding fra 10−1 i række B til 10−6 i række G.
    5. Der pipetteres 100 μL af hvert hul på en passende agarplade med vækst og spredes over pladen for at sprede cellekulturen. Pladerne anbringes i en inkubatorryster natten over ved 37 °C. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
    6. Undersøg pladerne og tæl dem, der har ca. 25-300 kolonier. Vælg om muligt plader med samme fortyndingsværdi. Brug antallet af kolonier pr. plade til at beregne CFU/ml.
  7. Evaluering af pH efter inkubation
    BEMÆRK: Følg producentens anvisninger for hver pH-metermodel.
    1. Forkalibrer et pH-meter ved hjælp af standardiseringsopløsninger af pH 4, pH 7 og pH 10. Aflæs hver bakterieprøve ved at placere pH-sonden i det 15 ml koniske rør.
  8. Forberedelse af prøver til ICP-OES
    BEMÆRK: ICP-OES anvendes til bestemmelse af koncentrationen af Mg 2+ og Ca2+ ioner. Disse kationer betragtes som vigtige, da hver deltager i cellulær metabolisme.
    1. Hvert 15 ml konisk rør, der er forberedt i trin 2.6.1, centrifugeres i 5 minutter ved 5,724 × g for at pelletere celle- og nanopartikelaffaldet.
    2. Med et konisk glas på 15 ml fortyndes 30 μl supernatanten til 2,97 ml 18,2 Ω filtreret vand for at skabe en 1:100 fortynding.
      BEMÆRK: Fortyndingsfaktoren kan justeres baseret på de projicerede ionkoncentrationer og spektrometerinstrumentets detektionsgrænse.
    3. Prøverne aflæses ved hjælp af ICP-OES.

3. Metode med direkte eksponering (metode B)

BEMÆRK: Hvis væksthastigheden for de valgte bakterier er ukendt, skal der gennemføres en standardisering af vækstkurven, inden denne metode implementeres.

  1. Bestem bakteriostatiske og bakteriedræbende aktiviteter i realtid ved eksponering for nanopartikler af interesse.
    1. De ønskede koncentrationer af nanopartikler fremstilles ved hjælp af metoderne beskrevet i trin 2.1-2.1.2.2. Der fremstilles to sæt af hver vægt af nanopartikler, der skal anvendes: et, der skal tilsættes til 3 ml alikvoter bakteriekultur i den logaritmiske vækstfase, og det andet, der skal tilsættes til 3 ml alikvoter vækstmedium uden bakterier som kontrolgrupper.
    2. Bestem passende bakteriostatiske og bakteriedræbende antibiotika til de bakteriearter, der skal testes.
      BEMÆRK: Kendskab til den mindste hæmmende koncentration for hvert antibiotikum er påkrævet.
  2. Beregn det samlede volumen bakteriekultur, der er nødvendig for tredobbelte 3 ml prøver for alle nanopartikel-, antibiotika- og kontrolprøver.
    BEMÆRK: Der kræves et tilsvarende volumen sterilt vækstmedium. Hvis der planlægges anvendelse af spektrofotometri, kræver dette, at der foretages justeringer af det samlede volumen, der er nødvendigt til indkvartering af det volumen på 0,5 ml til 1,0 ml, der er nødvendigt for kuvetter.
  3. Dag 1: For hvert in vitro-forsøg oprettes der dag-til-dag-lagre efter trin 2.2.1-2.2.2.
  4. Dag 2: Bekræft, at pladelæserindstillingerne kan rumme en plade med 96 brønde med en optisk densitet på 600 nm. Prøverne måles i 200 μL alikvoter ved hjælp af en plade med 96 huller.
    1. Bestem en indledende bakteriekultur OD600 ved 0,01 - densiteten, der bruges til at starte den indledende inkubationsperiode før tilsætning af nanopartikler og antibiotika.
    2. Saml natten over bakteriekulturen fra inkubator-rysteren.
      1. For hvert materiale (f.eks. forudmålte nanopartikler eller antibiotika), der skal testes, oprettes en separat bakteriekultur ved en OD600 på 0,01. Brug en beholder, der er stor nok til at rumme den nødvendige mængde cellekultur (f.eks. En steriliseret Erlenmeyerkolbe eller 50 ml koniske rør).
      2. Bakterieprøverne natten over fortyndes med vækstmedium ved at anbringe tre 200 μL alikvoter af vækstmediet i tre huller og tre 200 μL alikvoter af bakteriekulturen i yderligere huller (f.eks. A1 til A6).
      3. Anbring 96-brøndspladen i pladelæseren, og scan den.
        BEMÆRK: Aflæsningerne beregnes som gennemsnit for hver scannet brønd for at producere en middelværdi.
      4. For at beregne densiteten af bakterier i suspension beregnes gennemsnittet af middelværdien for hvert hul, der indeholder en tredobbelt prøve.
      5. For at bestemme bakteriens optiske tæthed trækkes bouillonprøvegennemsnittet fra bakteriegennemsnittet.
      6. Hvis det er nødvendigt at fortsætte med at justere bakteriesuspensionen, fortsættes med at tilføje bouillon eller bakteriekultur natten over efter behov, og scanning gentages i pladelæseren efter behov, indtil en OD600 på ca. 0,01 er nået.
      7. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 150 omdr./min., indtil logaritmisk vækst er nået.
  5. Fjern bakteriekulturerne fra inkubatorrysteren.
    1. Alikvote 3 ml OD600 0,01 bakteriekultur i mærkede 15 ml koniske rør til test- og kontrolprøver i tre eksemplarer.
    2. Der afprøves 200 μL bakteriekultur i tre huller i en plade med 96 huller, og prøverne måles ved hjælp af pladelæseren.
    3. Aflæsningerne beregnes som beskrevet tidligere i trin 3.4.2.2 og 3.4.2.6-aflæsningen "-0,5 timer".
  6. Dannelse og måling af bakterie/nanopartikelblandinger
    1. Alikvote 3 ml sterilt vækstmedium i lige antal til bakteriekulturerne i mærkede 15 ml koniske rør til kontrolprøver (i tre eksemplarer).
    2. For at forberede bakterier / nanopartikelsuspensioner og sterile medier / nanopartikelsuspensioner fjernes 1 ml bakteriekultur eller medium fra hvert tredobbelt sæt af 15 ml koniske rør.
      1. De alikvoter på 1 ml anbringes i et 5 ml centrifugeglas indeholdende forudmålte nanopartikler, og hvirvlen anbringes kortvarigt for at blande.
      2. Fra 5 ml centrifugerøret returneres 1 ml alikvoter af bakterierne / nanopartikelsuspensionerne eller medium / nanopartikelsuspensionerne til det 15 ml koniske rør for at fordele nanopartiklerne homogent.
        BEMÆRK: Pipetten af bakterie/nanopartikelblandingen 2x-3x før hver 1 ml alikvote pipetteres for at opretholde nanopartiklerne i suspension.
  7. Fremstilling og måling af bakterier/antibiotikablandinger
    1. For at skabe de bakterielle / antibiotiske kulturer, alikvote 3 ml af den inkuberede bakteriekultur i de tilsvarende mærkede 15 ml koniske rør.
    2. Når alle prøverne er forberedt, alikvotes 200 μL af hver prøve i de enkelte huller på en plade med 96 huller.
    3. Anbring pladen/pladerne i pladelæseren, og start scanningen af "0 h"-aflæsningen.
    4. De koniske 15 ml rør, der indeholder prøverne, anbringes i en rugekasse/ryster ved 37 °C og 150 o/min. Alle data registreres som beskrevet tidligere i trin 3.4.2.2 og 3.4.2.6.
  8. Ca. 15 minutter efter afslutningen af 0 timers aflæsningen gentages trinnene beskrevet i trin 3.7.2-3.7.3-aflæsningen "0,5 timer".
    1. Efter de etablerede 0 timer gentages trinnene beskrevet i trin 3.7.2-trin 3.7.3 hvert 90. minut i seks cyklusser; Færdig på 9 timer.
    2. Efter afslutningen af sjette cyklus anbringes prøverne i rugekasserysteren i yderligere 15 timer ved 37 °C og 150 o/min. Gentag trinnene beskrevet i trin 3.7.2-3.7.3 for at opnå aflæsningen på 24 timer. Alle data registreres som beskrevet tidligere i trin 3.4.2.2 og 3.4.2.6.

4. Direkte kulturmetode (metode C)

BEMÆRK: I metode C placeres bakterier i en lag-fase såkultur direkte på de nanostrukturerede overflader af interesse. Til undersøgelse af nanostrukturens antimikrobielle aktiviteter følger vi en protokol beskrevet af Zhang et al.14. For at demonstrere denne direkte kulturmetode blev ZC21 (Mg-Zn-Ca legering) og Mg stifter anvendt som prøver.

  1. Forberedelse og dyrkning af bakteriekulturerne
    1. For hvert in vitro-forsøg oprettes der dag-til-dag-bestande efter trin 2.2.1-2.2.2.
  2. Vask og tælling af bakterierne for at bestemme såtætheden
    BEMÆRK: Den ønskede såtæthed på 7,5 × 105 CFU / ml blev identificeret som den rapporterede cellekoncentration, der forårsager ortopædiske infektioner14.
    1. Hent den natten over bakterielle kultur fra inkubator-shakeren.
    2. Bakterierne vaskes og opsamles efter trin 2.3.2-2.3.2.3, men det friske substrat erstattes med revideret simuleret kropsvæske (rSBF) for hvert vasketrin.
      BEMÆRK: rSBF er en bufferopløsning, der efterligner den ioniske koncentration af humant blodplasma. Imidlertid indeholder rSBF kun uorganiske forbindelser og er uden bioorganiske forbindelser såsom proteiner. For at løse dette kombineres føtalt bovint serum (FBS) med rSBF for at simulere sammensætningen af humant blod for bedre at efterligne den naturlige dannelse af apatit i forkalket væv under eksperimentelle betingelser36.
    3. Supernatanten fjernes fra de pelleterede celler. Resuspender cellepillen i 1 ml rSBF suppleret med 10% FBS-cellesuspensionen.
    4. Bestem cellesuspensionskoncentrationen (celler / ml) ved hjælp af et hæmocytometer. Cellesuspensionen fortyndes til en koncentration på 7,5 × 10,5 celler/ml i rSBF suppleret med 10% FBS. Opret en såkultur ved at følge trin 2.4.1.
    5. Den faktiske såtæthed bestemmes efter trin 2.4.2.
  3. Bakteriel cellesuspension fordeles på prøverne i dyrkningsbrøndene.
    1. Både prøverne og kontrolprøverne anbringes i de enkelte brønde i en 48-brønds, ikke-vævsbehandlet polystyrenplade.
    2. Der anvendes en prøve på 0,75 ml cellesuspension i hvert hul, der indeholder prøverne og kontrollerne. 48-brøndspladen (pladerne) anbringes i en inkubator-ryster i 24 timer ved 37 °C under omrystning ved 120 omdr./min.
  4. Karakterisering af bakteriekoncentrationen
    1. Efter 24 timers inkubation samles prøverne og anbringes i separate, mærkede opsamlingsrør.
    2. Saml to prøver fra hver gruppe og placer dem individuelt i mærkede 5,0 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 2 ml rSBF til hvert rør.
    3. Placer prøverne indsamlet i trin 4.4.2 i et sonikeringsbad og sonikere i 10 minutter. Efter hver 5 minutters periode hvirvel hver prøve i 5 s.
    4. Opsaml rSBF'en, der indeholder de nyligt løsrevne bakterieceller, og anbring suspensionen i et mærket, frisk mikrocentrifugerør.
  5. Serielle fortyndinger og plettering af bakterierne
    1. Bakteriesuspensionen fortyndes serielt og plades efter trin 2.6.2-2.6.6.
  6. Evaluer pH efter inkubation af kulturmedier ved at følge trin 2.7.
  7. Postkulturmediet forberedes til ICP-OES ved at følge metoderne beskrevet i trin 2.8.

5. Metode til eksponering for fokuseret kontakt (metode D)

BEMÆRK: I metode D sættes bakterier på et nitrocellulosefilterpapir i direkte kontakt med et interesseområde på de nanostrukturerede overflader. Denne metode minimerer interferensen af nedbrydning af bulkprøver i bakteriekulturer med bakterieaktiviteterne. For at undersøge nanooverfladeantimikrobielle aktiviteter følger vi en protokol beskrevet af Lin et al.16.

  1. Følg procedurerne i trin 2.2.1-2.2.2.1 for at skabe en bakteriel såkultur. Den faktiske såtæthed kontrolleres efter trin 2.4.2.
  2. Forbered prøverne til en størrelse på 1 × 1 cm2 i firkantet form. Forbered alle prøvetyperne i tre eksemplarer. Anbring om nødvendigt prøverne på en tredimensionel (3D) holder, der er 15 mm i diameter og 10 mm i højden. Prøven og holderen anbringes i en brønd i en brøndplade, der ikke er behandlet med vævskultur.
  3. Forbered steriliseret nitrocellulosepapir ved at trimme hver til en diameter på 1 cm. Det tilberedte nitrocellulosepapir anbringes på en agarplade, der indeholder det passende substrat.
  4. 50 μL af den fortyndede bakteriekultur pipetteres på filtrerpapiret.
  5. Der afpipetteres 50 μL af et passende substrat midt på hver prøveoverflade.
  6. Brug steriliseret pincet til at hente nitrocellulosepapiret fra agarens overflade. Vend forsigtigt nitrocellulosepapiret og læg det på prøveoverfladen, så bakterierne er i kontakt med 50 μL medium og den nanostrukturerede overflade af interesse.
  7. Tilsæt 1 ml Tris-buffer til hvert hul, der indeholder en prøve for at opretholde fugtigheden. Polystyrenbrøndpladen indeholdende alle prøverne inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
  8. Nitrocellulosepapiret opsamles fra hver prøveoverflade. Anbring hver i 5 ml Tris buffer. Vortex de indsamlede filterpapirer og nanosurfaced materialeprøver i 5 s.
  9. Sonikere hver prøve i 10 min. Vortex i 5 s efter 5 min og igen efter 10 min.
  10. Tris-stødpudesuspensionerne opsamles fra alle prøverne, og hvert volumen anbringes i individuelle friske opsamlingsrør.
  11. Prøverne fortyndes serielt og plades efter trin 2.6.2-2.6.6.

6. Postkulturel karakterisering af bakterier og nanomaterialer

  1. Undersøgelse af bakteriel adhæsion og morfologi ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM)
    1. Efter inkubation natten over tilsættes 10% glutaraldehyd i hver brønd i den 48-brønds, ikke-vævsbehandlede polystyrenplade, indtil prøverne er helt dækket. Inkuber prøverne i 1 time for at fiksere bakteriecellerne.
    2. Opsug glutaraldehydet i en affaldsflaske og skyl alle prøverne 3x med Tris-bufferopløsning for at fjerne ikke-klæbende bakterier.
    3. Dehydrer prøverne med 30%, 75% og 100% ethanol i 30 minutter hver16.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge en kritisk punkttørrer til at tørre prøverne. Det er ikke ideelt at lufttørre prøverne ved stuetemperatur i 24 timer.
    4. Brug ledende tape, såsom kobber- eller kulstofbånd, til at fastgøre prøverne på en SEM-stub. Overtræk prøveoverfladerne via sputterbelægning for at give ledningsevne før billeddannelsen (f.eks. belæg Mg-plader med klæbende bakterier under platin/palladium (Pt/Pd) i 45 s ved 20 mA16).
      BEMÆRK: Belægningsmaterialerne, behandlingstiden og driftsstrømmen kan variere afhængigt af prøvetyperne.
    5. Tag billeder af bakterierne på prøverne ved hjælp af SEM med en passende arbejdsafstand og accelererende spænding og ved de ønskede forstørrelser. Brug for eksempel en SEM med en sekundær elektrondetektor til at tage billeder i en arbejdsafstand på 5 mm og en accelererende spænding på 10 kV16.
  2. Undersøg overflademorfologi af nanomaterialeprøver efter dyrkning ved hjælp af SEM.
    1. For nanomaterialer vaskes prøverne ved hjælp af Tris-buffer 3x for at fjerne de frie bakterier, der ikke er fastgjort til prøven. For nanopartikler spredes partiklerne i et opløsningsmiddel, der ikke påvirker prøveegenskaberne gennem ultralydbehandling for at opnå bedre dispersion, når det er nødvendigt.
    2. Tør prøverne efter vaskeproceduren.
    3. Brug dobbeltklæbende tape af kulstof eller kobber til at klæbe prøverne på SEM-stubben.
    4. Der oprettes et ledende overfladelag af Pt/Pd ved hjælp af en sputtercoater som beskrevet i trin 6.1.4 før billeddannelsen. Tag eksempelbillederne som beskrevet i trin 6.1.5.
    5. Overfladeelementsammensætningen analyseres ved hjælp af EDS med en passende accelererende spænding og ved de ønskede forstørrelser (f.eks. ved 10 kV efter udførelse af SEM-analysen16).
  3. Fluorescensbilleddannelse af bakteriel vedhæftning
    1. Forbered prøverne, der skal visualiseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi ved først at vaske dem med Tris-buffer 3x. Lufttør prøverne ved stuetemperatur.
    2. Plet hver prøve med 10 μM thioflavin T-fluorescensfarvestof efter den etablerede protokol37.
    3. Udfør fluorescensbilleddannelse af bakteriel vedhæftning ved hjælp af et inverteret mikroskop kombineret med et elektronmultiplicerende ladningskoblet enhedsdigitalkamera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifikationen af den antibakterielle aktivitet af magnesiumoxidnanopartikler og nanostrukturerede overflader er blevet præsenteret ved hjælp af fire in vitro-metoder , der kan anvendes på tværs af forskellige materialetyper og mikrobielle arter.

Metode A og metode B undersøger bakterieaktiviteter, når de udsættes for nanopartikler i en lagfase (metode A) og logaritmisk fase (metode B) i en varighed på 24 timer eller længere. Metode A giver resultater vedrørende MIC og MBC, mens metode B bestemmer nanopartiklernes hæmmende versus bakteriedræbende virkninger. Metode C undersøger de bakterielle aktiviteter med direkte og indirekte kontakt med nanostrukturerede overflader, og metode D undersøger bakterieaktiviteterne på et udvalgt område af en celle-nanostruktur-grænseflade i en varighed på 24 timer eller længere.

De anvendte metoder er beskrevet i figur 1 og figur 2, og deres resultater er vist i figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. Repræsentative eksperimentelle resultater, der kvantificerer antimikrobiel aktivitet af nMgO mod gramnegative og grampositive bakterier og gær, kan ses i figur 3. De antibakterielle aktiviteter af nMgO og nMg(OH)2 mod MRSA kan ses i figur 4. De nanostrukturerede overfladers antibakterielle aktiviteter mod MRSA kan ses i figur 5 og figur 6. Endelig kan magnesiumlegeringers antibakterielle aktivitet mod E. coli ses i figur 8B.

Ved hjælp af metode A er det muligt at bestemme MIC'er og MBC'er for bakterier udsat for nanopartikler ved hjælp af ensartede metoder og materialer. Denne konsistens gør det muligt at foretage sammenligninger mellem arter ved hjælp af de identificerede MBC'er for at bestemme den mest potente koncentration af testede nanopartikler. Derudover kan denne metode også anvendes på andre klassifikationer af mikroorganismer til sammenligning af MIC'er og minimale dødelige koncentrationer (MLC'er17). Her blev steriliserede nanopartikler forudmålt i en mængde, der tillod tredoblinger af hver påkrævet koncentration. Disse nanopartikler blev suspenderet i en lag-fase mono-bakterie såkultur med en densitet på 6 × 10 6-8 × 106 celler / ml. Den beskrevne metode til at suspendere de forudmålte nanopartikler med såkultur eller bouillon skabte med succes tredobbelte prøver, der var relativt homologe i nanopartikelfordeling, hvilket kan reducere afvigelsen i CFU / ml inden for tredobbelte prøver. Den eksperimentelle arbejdsgang for denne metode er illustreret i figur 1A. En demonstration af de antimikrobielle virkninger af nMgO på gramnegative og grampositive bakterier og Candida spp. ved hjælp af metode A kan ses i figur 3. Her blev der identificeret en MIC på 1,0 mg/ml nMgO for gramnegative Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa samt en MBC 99,99 på henholdsvis 1,0 mg/ml og1,6 mg/ml nMgO for disse arter (figur 3A). Gram-positive S. epidermidis, S. aureus og MRSA viste MIC på henholdsvis 0,5 mg / ml, 0,7 mg / ml og 1,0 mg / ml nMgO. MBC 99,99 værdier på 1,6 mg/ml og1,2 mg/ml nMgO blev identificeret for henholdsvis S. epidermidis og S. aureus, mens MRSA ikke blev reduceret ud over MBC90 (figur 3B). I lægemiddelfølsomme og lægemiddelresistente Candida spp., C. albicans og C. albicans FR blev MIC på henholdsvis 1,2 mg/ml og 1,0 mg/ml nMgO identificeret. I modsætning hertil viste nMgO MIC-værdier på 1,0 og 0,7 mg/ml for henholdsvis C. glabrata og C. glabrata ER. Derudover nåede hver Candida-art en MBC 90 på 0,7-1,2 mg/ml nMgO, men kun C.glabrata ER blev reduceret til MBC 99,99 ved1,2 mg/ml nMgO (figur 3C). Derudover blev identifikationen af den mest potente koncentration (MPC) af nMgO bestemt i de fleste testede arter. MPC angiver den nanopartikelkoncentration, der er mest effektiv på tværs af polymikrobielle samfund17.

Metode B udsætter bakterier i den logaritmiske vækstfase for nanopartikler med visse koncentrationer for at bestemme, om nanopartiklerne er bakteriostatiske (hæmmende) eller bakteriedræbende ved hjælp af MBC'erne identificeret i metode A. Denne metode bruger spektrofotometri (OD600) målinger over diskrete tidsperioder til at identificere ændringer i bakterievækst som reaktion på nanopartikeleksponering. Derudover dyrkes bakterier, der udsættes for bakteriostatiske eller bakteriedræbende antibiotika, samtidig med de nanopartikeleksponerede bakterier i separate brønde for at give en reference til identifikation af disse nanopartikelaktiviteter. De anvendte koncentrationer af nMgO og nMg(OH)2 blev udledt af en tidligere undersøgelse med bakterier i den logaritmiske vækstfase eksponeret for nMgO og nMg(OH)2. Koncentrationerne af nMgO og nMg(OH)2 blev identificeret ved hjælp af mM-ækvivalenter fra 5 mM til 50 mM. Resultaterne viste, at nMgO var bakteriedræbende over for MRSA ved 30 mM (1,2 mg/ml nMgO), mens nMg(OH)2 var bakteriostatisk ved 50 mM (2,9 mg/ml nMg(OH)2). De anvendte koncentrationer af antibiotika blev identificeret fra litteraturen og bekræftet i vores egne forsøg. Den eksperimentelle arbejdsgang for denne metode er illustreret i figur 1B. Repræsentative resultater for metode B kan ses i figur 4. Her voksede MRSA uden eksponering for nanopartikler eksponentielt til600 OD på 0,85. Ved eksponering for 1,2 mg/ml nMgO og 6,25 μg/ml trimethoprim blev bakterievæksten reduceret til en OD 600 på 0,18 (henholdsvis 80,2% og 81,6%), og 2,9 mg/ml nMg(OH)2 reducerede bakterievæksten til en OD600 på 0,25 (70,3%). Eksponering for 1,0 μl/ml vancomycin resulterede i en 99,99% reduktion i væksten af MRSA, hvilket tyder på, at koncentrationerne af nMgO og nMg(OH)2, der anvendes her, var bakteriostatiske i aktivitet.

Metode C undersøger nanostrukturerede overfladers antibakterielle aktivitet. En bakteriekultur i lag-fase vækst blev podet direkte på en nanostruktureret overflade for at måle CFU'er med eller uden direkte kontakt med overfladen. Ved hjælp af denne metode var det muligt at bestemme overfladevirkningerne på bakteriel vedhæftning og levedygtighed under direkte kontaktbetingelser. Bakterier i direkte kontakt med de nanostrukturerede overflader og i indirekte kontakt (i dyrkningssuspension) blev indsamlet og kvantificeret i CFU / ml for at bestemme bakterievæksten under hver tilstand. Disse opnåede data kan være nyttige i downstream-applikationer af nanostrukturerede materialer på overflader til klinisk brug, hvor der ønskes en reduktion i bakteriekolonisering på overfladestrukturer. Den eksperimentelle arbejdsgang for denne metode er illustreret i figur 2A. Repræsentative resultater for metode C kan ses i figur 5. Her var der ingen hæmning af bakterievækst med indirekte kontakt. Imidlertid blev bakteriel vedhæftning reduceret for alle substrater, mest signifikant med ZC21-legeringen, efterfulgt af henholdsvis T64 (titanium), magnesium, kun glas og ZSr41-legeringen. Disse resultater indikerer, at ZC21 havde den stærkeste antibakterielle aktivitet mod vedhæftning og vækst af MRSA for alle de testede prøver14.

Metode D undersøger antibakteriel aktivitet på et udvalgt interesseområde ved celle-nanostruktur-grænsefladen gennem direkte placering af bakterier i filterpapir på en nanostruktureret overflade. Ved hjælp af denne metode kan der identificeres en sammenhæng mellem antibakteriel aktivitet og overfladeegenskaber, såsom overfladekemi, ruhed og areal af den nanostrukturerede overflade16. Den eksperimentelle arbejdsgang for denne metode er illustreret i figur 2B. Repræsentative resultater for metode D kan ses i figur 6. Her blev der ikke identificeret nogen levedygtig S. aureus på 1.9A-, 1.9 AA- og EPD-prøverne eller deres parrede filterpapir. Eksponering for EPD-prøverne efter udglødning (A-EPD) reducerede imidlertid bakterievæksten til nogle få celler på den nanostrukturerede overflade og det parrede filterpapir. Prøven indeholdende magnesium (Mg) havde heller ingen bakterievækst, men levedygtige bakterier blev isoleret fra det parrede filterpapir. En reduktion i væksten af S. aureus blev ikke set med titan- og glasprøverne eller deres parrede filterpapir16.

Ud over anvendelsen af de ovenfor beskrevne metoder til bestemmelse af antimikrobielle aktiviteter kan SEM og fluorescensmikroskopi anvendes til at karakterisere de morfologiske ændringer, der forekommer i mikroorganismer efter eksponering for nanopartikler og nanostrukturerede materialer. De repræsentative SEM-billeder, der viser de gramnegative Escherichia coli efter eksponering, er vist i figur 7A, og billederne, der viser den grampositive S. aureus efter eksponering, er vist i figur 7B. Ved hjælp af SEM-billeddannelsesteknikken med en 5.000x forstørrelse kunne fænotypiske ændringer i E. coli udsat for koncentrationer på 0,5 mg / ml nMgO eller højere identificeres17. Fluorescensmikroskopi kan også bruges til at karakterisere morfologiske ændringer i mikroorganismer, men med potentielt lavere omkostninger og større tilgængelighed end SEM. Figur 8 viser repræsentative fluorescensbilleder af E. coli eksponeret for det nanostrukturerede materiale MgY_O i 1 dag, 2 dage og 3 dage samt reference E. coli. Kun en bakterieart, E. coli, blev oprindeligt brugt. I fremtiden vil vi overveje at udsætte yderligere bakteriearter for de samme materialer af interesse for at producere en mere omfattende forståelse af bakterielle reaktioner på MgY_O eksponering. I disse resultater kunne individuelle E. coli-celler og kolonier ses og afbildes ved hjælp af thioflavin T-farvning og et fluorescensmikroskop til kvalitativ analyse af den antibakterielle aktivitet af MgY_O15.

Figure 1
Figur 1: Skematiske diagrammer til bestemmelse af nanopartikel MIC eller MBC90-99.99 og bakteriostatiske eller bakteriedræbende aktiviteter i post-exposure cellekulturer . (A) Direkte samkulturmetode17. B) Metode med direkte eksponering. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheder; NP'er = nanopartikler; OD600 = optisk densitet ved 600 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematiske diagrammer til bestemmelse af bakterievækst ved direkte og indirekte kontakt og ved celle-nanostrukturgrænsefladen mellem nanostrukturerede overflader. A) Direkte kulturmetode14. B) Metode til eksponering for fokuseret kontakt16. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheder; SEM = scanning elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentation af levedygtige bakterier og gær kvantificeret ved CFU/ml 24 timer efter eksponering for 0-2,0 mg/ml nMgO. (A) CFU/ml af gramnegative bakterier, herunder E. coli og P. aeruginosa. B) CFU/ml grampositive bakterier, herunder S. epidermidis, S. aureus og methicillinresistente S. aureus. (C) CFU/ml af lægemiddelmodtagelige C. albicans, lægemiddelresistente C. albicans FR, lægemiddelmodtagelige C. glabrata og lægemiddelresistente C. glabrata ER. Data er repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (N = 9). *p ≤ 0,05, signifikant lavere end grupperne ved 0-0,7 mg/ml nMgO for den respektive bakterie eller gær. ^p ≤ 0,05, signifikant lavere end grupperne ved 0-1 mg/ml nMgO for den respektive mikroorganisme. #p ≤ 0,05, signifikant lavere end grupperne ved 0-0,5 mg/ml nMgO for den respektive mikroorganisme. &p ≤ 0,05, signifikant lavere end grupperne ved 0-0,3 mg/ml nMgO for den respektive mikroorganisme17. Dette tal er modificeret fra Nguyen et al.17. Forkortelser: FR = fluconazolresistent; ER = echinocandin-resistent; nMgO = nanopartikler af magnesiumoxid; CFU = kolonidannende enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentation af optiske densitetsaflæsninger (OD600) taget i realtid for methicillinresistente S. aureus. MRSA-eksponering for 1,2 mg/ml nMgO, 2,9 mg/ml nMg(OH)2, 6,25 μg/ml trimethoprim og 1,0 μg/ml vancomycin i 24 timer. p ≤ 0,025: væksten af MRSA eksponeret for 1,0 μg/ml vancomycin ved 0,5 timer er signifikant lavere end væksten af MRSA eksponeret for 2,9 mg/ml Mg(OH)2 ved 7,5 timer. ^p ≤ 0,025: væksten af MRSA eksponeret for 1,0 μg/ml vancomycin 24 timer efter podning er signifikant lavere end væksten af MRSA eksponeret for 2,9 mg/ml Mg(OH)2 ved 24 timer. Data præsenteres som middelværdien ± standardfejlen for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentation af levedygtig methicillinresistent S. aureus kvantificeret ved CFU/ml ved 24 timer efter eksponering for prøver og kontroller. Bakterier blev podet med en faktisk densitet på 7,5 × 105 celler / ml og bekræftet af CFU / ml. Data repræsenteres som gennemsnittet ± standardafvigelsen, n = 3; *p < 0,05. Equation 1p < 0,05 sammenlignet med CFU'en på ZC21-prøver. Denne figur blev ændret fra Zhang et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentativ kvantificering ved CFU/ml af bakteriesåtætheden 24 timer efter eksponering for overfladebehandlede Mg-prøver af 1,9 A, 1,9 AA, EPD og A-EPD samt Mg- og Ti-kontrolprøver. Bakterier blev podet med en faktisk tæthed på 6 × 106 CFU / ml, som repræsenteret af den røde stiplede linje. Data repræsenteres som gennemsnittet ± standardafvigelsen; n = 3. *p < 0,05. Den udfyldte sorte linje angiver de statistiske analyseresultater for bakterietætheden på prøveoverfladerne. Den blå stiplede linje angiver de statistiske analyseresultater for bakterietætheden på filtrene, der dækker prøveoverfladerne. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheder; A-EPD = elektroforetisk aflejring efter udglødning; EPD = elektroforetisk aflejring før udglødning; A = anodisering før udglødning; AA = anodisering efter udglødning. Dette tal blev ændret fra Lin et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative SEM-billeder af gram-negative E. coli og gram-positive S. aureus eksponeret for 0-1,2 mg/ml nMgO. (A) E. coli viste lignende morfologi ved 1,2 mg/ml til 2,0 mg/ml nMgO. Af denne grund vises et billede ved 1,2 mg / ml som repræsentativt for E. coli udsat for højere nMgO-koncentrationer. (B) S. aureus viste også lignende morfologi ved 1,2 mg/ml til 2,0 mg/ml nMgO. Af denne grund vises et billede ved 1,2 mg / ml som en repræsentant for S. aureus udsat for højere nMgO-koncentrationer17. Skalastænger = 5 μm. nMgO = magnesiumoxid nanopartikler. Dette tal blev ændret fra Nguyen et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative fluorescensbilleder af E. coli klæbet til substraterne med kvantificering efter 1 dag, 2 dage og 3 dages inkubation. (A) Fluorescensbilleder af E. coli farvet med 10 μM thioflavin T. (B) Kvantificering af E. coli eksponeret for materialer af interesse ved hjælp af celler/ml. Der var ingen bakteriel adhærens til MgY_O efter 2 dages inkubation og nedsat adhærens til MgY efter 3 dages inkubation. Skalabjælke = 10 μm. Dette tal blev ændret fra Lock et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har præsenteret fire in vitro metoder (A-D) til at karakterisere nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antibakterielle aktiviteter. Mens hver af disse metoder kvantificerer bakterievækst og levedygtighed over tid som reaktion på nanomaterialer, findes der en vis variation i de metoder, der anvendes til at måle den oprindelige bakterielle såtæthed, vækst og levedygtighed over tid. Tre af disse metoder, metoden med direkte samkultur (A)17, metoden med direkte kultur (C)14 og metoden med fokuseret kontakteksponering (D)16, kvantificerer bakterievækst og levedygtighed efter en periode med eksponering for nanomaterialer ved at tælle CFU'erne pr. volumenenhed. Til sammenligning kvantificerer metoden med direkte eksponering (B) bakterievækst via diskrete målinger i realtid optisk densitet (OD600). Denne metode kan også anvendes på metoderne til direkte samkultur, direkte kultur og fokuseret kontakteksponering, hvis der er tidsbegrænsninger for kvantificering af CFU'er, og / eller en realtidsbakterietæthedsaflæsning er nødvendig for kinetiske undersøgelser. Hvis der ikke kendes effektive antibiotika for de bakteriearter, der skal testes i metoden med direkte eksponering, skal der foretages en litteratursøgning for at bestemme de korrekte antibiotika og deres MIC-værdier, der skal tjene som referencer for nanomaterialegrupperne. En bekræftelse af MIC-værdierne kan foretages ved at udfylde en standardiseringskurve, som plotter forholdet mellem spektrofotometridataene og kvantificeringen af kolonidannende enheder på bestemte tidspunkter. Denne proces korrelerer antallet af celler, der er til stede i kultur på bestemte punkter, med den respektive optiske tæthed. Derudover introduceres bakterier i lag-stadiet til nanopartikler i den direkte samkulturmetode og nanostrukturerede overflader i metoderne til direkte kultur og fokuseret kontakteksponering. I modsætning hertil introduceres bakterier på det logaritmiske vækststadium til nanopartikler i metoden med direkte eksponering. Desuden kvantificeres bakteriel såtæthed som celler / ml i direkte samkulturmetoden, den direkte kulturmetode og den fokuserede kontakteksponeringsmetode, mens bakteriernes optiske densitet (OD600) måles for at spore realtidsvækst i direkte eksponeringsmetoden.

Selvom hver af disse metoder er ens i rammer, præsenterer de også unikke egenskaber for at skelne mellem virkningerne af nanopartikler eller nanostrukturerede overflader på bakterier. For eksempel karakteriserer den direkte co-kulturmetode bakterielle reaktioner på stigende forudmålte koncentrationer af nanopartikler ved CFU / ml kvantificering (figur 3). Denne metode genererer minimale hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer (MIC og MBC) af nanopartikler for mikrobielle arter af interesse og, hvis flere arter undersøges, den mest potente koncentration (MPC) af nanopartikler17. Identifikationen af MIC, MBC90-99.99 og MPC er afgørende for anvendelsen af nanopartikler i downstream-applikationer. For eksempel kan disse data anvendes til in vivo-undersøgelser af nanopartikelantibakteriel aktivitet, samtidig med at cytokompatibiliteten opretholdes, når der også er identificeret mindre end dødelige koncentrationer. I modsætning hertil karakteriserer metoden med direkte eksponering nanopartikelaktivitet som bakteriostatisk eller bakteriedræbende på en måde, der svarer til klassificeringen af antibiotika, hvor synergistiske eller uønskede virkninger skal identificeres inden brug i forsknings- eller kliniske omgivelser.

Karakteriseringen af antibakterielle forbindelser som bakteriostatiske eller bakteriedræbende er relevant for klinisk anvendelse og in vitro- og in vivo-forskning 38. Af denne grund skal eventuelle negative virkninger, der kan påvirke resultaterne, identificeres, når der udformes metoder til undersøgelse af disse egenskaber. Her kategoriserer metoden med direkte eksponering nanopartikler som bakteriostatiske eller bakteriedræbende for specifikke bakteriearter ved hjælp af realtidsmålinger af optisk densitet ved 600 nm (figur 4). Bakterier i den logaritmiske vækstfase blandes med nanopartikler på MIC-niveau for at skabe bakterier og nanopartikelsuspensioner. Disse suspensioner måles diskret i realtid for at bestemme de igangværende virkninger af nanopartikeleksponering på bakterierne. For at verificere de opnåede resultater fungerer samtidigt dyrkede bakterier i suspension med bakteriostatiske og bakteriedræbende antibiotika som reference for at bekræfte væksthastighederne for de nanopartikeleksponerede bakterier.

Inkorporering af nanopartikler i bioteknologi, klinisk og miljøvidenskab kan have vidtrækkende muligheder, men det er udfordrende at bruge nanopartiklers antibakterielle data til in vitro - og in vivo-undersøgelser på nanostrukturerede overflader. Af denne grund præsenterede vi de direkte kultur- og fokuserede kontakteksponeringsmetoder til at karakterisere in vitro antibakterielle aktiviteter af nanostrukturerede overflader. Den direkte kulturmetode undersøger de antibakterielle virkninger af nanostrukturerede overflader, når bakterier er i direkte kontakt med de interessante materialer14. Her udsættes bakterier suspenderet i rSBF plus 10% FBS for nanostrukturerede overflader, efterfulgt af kvantificering af bakterievækst over tid for bakterier i direkte kontakt med overfladen og i suspension omkring materialet af interesse (indirekte kontakt) ved hjælp af CFU / ml. Tidligere har eksperimentelle resultater, der involverer magnesiumlegeringsnanostrukturer (ZC21- og ZSr41-legeringer), indikeret, at antibakterielle aktiviteter øges, når bakterierne er i direkte kontakt med nanostrukturerede overflader sammenlignet med indirekte kontakt, hvor bakterierne forbliver i suspension med ringe eller ingen kontakt14 (figur 5). Endelig karakteriserer fokuskontaktmetoden antibakteriel aktivitet ved grænsefladen mellem bakterier og en nanostruktureret overflade16. Her undersøgte vi magnesiumoxid anodiseret eller elektroforetisk deponeret på overfladen af en bioresorberbar magnesiumlegering for at bestemme den potentielle forstyrrelse af bakteriel vedhæftning og biofilmdannelse over tid. Forstyrrelsen af biofilmdannelse kan være kritisk for patientens helingsprocesser, da biofilm har tendens til at undgå værtsimmunresponser og antibiotikabehandlinger39 og resultere i infektioner, der er ekstremt vanskelige at behandle.

Her præsenterer vi en metode tilpasset fra den japanske industristandard JIS Z 2801: 200016. Denne metode sikrer, at bakterier bindes til sterilt nitrocellulosefilterpapir efterfulgt af eksponering for et fast område af den nanostrukturerede overflade. Dette begrænser karakteriseringen af overfladevirkningerne på antibakteriel aktivitet til kun testområdet. I de repræsentative resultater viste anodiseringen før udglødning (1.9A), anodisering efter glødning (1.9AA) og elektroforetisk aflejring før glødning (EPD) prøver signifikante virkninger på reduktion af bakterievækst såvel som deres tilsvarende filterpapir sammenlignet med magnesium-, titanium- og glaskontrolprøverne. Den elektroforetiske aflejring efter udglødningsprøver (A-EPD) var også effektive til at reducere bakterievækst, men dette resultat var mindre signifikant sammenlignet med resultaterne opnået for 1,9A-, 1,9AA- og EPD-prøverne16 (figur 6).

Sammenfattende er hver in vitro-metode , der præsenteres her, rimelig let at mestre og inkorporerer billige og let tilgængelige materialer. Disse metoder kan bruges til at karakterisere interaktioner mellem en lang række nanomaterialer og mikrobielle arter, der er af interesse for forskere. Forståelse af ligheder og forskelle mellem disse metoder er nødvendig for at designe optimale eksperimenter for at opfylde forskningsmålene. Her kan den videnskabelige viden, der opnås fra disse in vitro-metoder , anvendes til downstream medicinske applikationer, hvor antibiotika skal begrænses eller repræsentere en ugunstig tilgang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne sætter pris på den økonomiske støtte fra US National Science Foundation (NSF CBET-pris 1512764 og NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Udvalget for Research Seed Grant (Huinan Liu) og UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant tildelt Patricia Holt-Torres. Forfatterne sætter pris på den hjælp, der ydes af Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) ved UC-Riverside til brug af SEM / EDS og Dr. Perry Cheung til brug af XRD. Forfatterne vil også gerne takke Morgan Elizabeth Nator og Samhitha Tumkur for deres hjælp med eksperimenterne og dataanalyserne. Eventuelle meninger, resultater, konklusioner eller anbefalinger udtrykt i denne artikel er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne fra National Science Foundation eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Tags

Bioengineering udgave 194 antimikrobielle nanopartikler nanostrukturerede overflader mindste hæmmende koncentration (MIC) minimum bakteriedræbende koncentration (MBC) dosisafhængig bakterie bakterier
Evaluering af antimikrobielle aktiviteter af nanopartikler og nanostrukturerede overflader <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu,… More

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter