Summary
Dit artikel presenteert twee methoden op basis van fluorescentie in situ hybridisatie om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te bepalen in niet-geënt en geënt ovariumschorsweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.
Abstract
Miljoenen mensen wereldwijd hebben te maken met problemen met betrekking tot vruchtbaarheid. Verminderde vruchtbaarheid, of zelfs onvruchtbaarheid, kan te wijten zijn aan veel verschillende oorzaken, waaronder genetische aandoeningen, waarvan chromosomale afwijkingen de meest voorkomende zijn. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een bekende en veelgebruikte methode om chromosomale afwijkingen bij de mens op te sporen. FISH wordt voornamelijk gebruikt voor de analyse van chromosomale afwijkingen in de spermatozoa van mannen met numerieke of structurele chromosomale afwijkingen. Bovendien wordt deze techniek ook vaak toegepast bij vrouwen om X-chromosomale afwijkingen te detecteren waarvan bekend is dat ze ovariële dysgenese veroorzaken. Informatie over het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen in lymfocyten en/of buccale cellen ontbreekt echter nog.
Het doel van deze studie is om fundamenteel onderzoek met betrekking tot X-chromosomale afwijkingen bij vrouwen te bevorderen, door twee methoden op basis van FISH te presenteren om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te identificeren. Eerst wordt een methode beschreven om het X-chromosomale gehalte van geïsoleerde eierstokcellen (eicellen, granulosacellen en stromale cellen) te bepalen in niet-geënt ovariële cortexweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. De tweede methode is gericht op het evalueren van het effect van chromosomale afwijkingen op folliculogenese door het bepalen van het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen van nieuw gevormde secundaire en antrale follikels in eierstokweefsel, van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen na langdurige transplantatie in immuungecompromitteerde muizen. Beide methoden kunnen nuttig zijn in toekomstig onderzoek om inzicht te krijgen in het voortplantingspotentieel van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen.
Introduction
Onvruchtbaarheid is een gezondheidsprobleem van het mannelijke of vrouwelijke voortplantingssysteem, dat wereldwijd ongeveer 186 miljoen personen in de vruchtbare leeftijd treft1. Bij ten minste 35% van de onvruchtbare paren wordt onvruchtbaarheid veroorzaakt door een aandoening van het vrouwelijke voortplantingssysteem2. Er zijn veel factoren die vrouwelijke onvruchtbaarheid kunnen veroorzaken, zoals genetische factoren, afwijkingen van het genitale kanaal, endocriene disfunctie, ontstekingsziekten en iatrogene behandeling3.
Genetische afwijkingen zijn aanwezig bij ongeveer 10% van de onvruchtbare vrouwen 4,5. Van alle genetische afwijkingen zijn X-chromosoomafwijkingen de meest voorkomende oorzaak van ovariële dysgenese2. Verschillende studies hebben gemeld dat X-chromosomale afwijkingen bij vrouwen met het syndroom van Turner (TS) of het Triple X-syndroom geassocieerd zijn met voortijdig ovarieel falen als gevolg van een versneld verlies van geslachtscellen of verminderde oogenese 6,7,8.
Afwijkingen van het X-chromosoom zijn onder te verdelen in: 1) numerieke aberraties, waarbij het aantal X-chromosomen verschillend is maar de X-chromosomen intact zijn; en 2) structurele afwijkingen, waarbij het X-chromosoom genetisch materiaal heeft gewonnen of verloren 3,9. Numerieke afwijkingen van het X-chromosoom komen vaker voor dan structurele afwijkingen en worden vaak veroorzaakt door spontane fouten tijdens celdeling 3,9. Wanneer een dergelijke fout optreedt tijdens meiose, kan dit leiden tot aneuploïde gameten en uiteindelijk tot nakomelingen met chromosomale afwijkingen in alle cellen. Wanneer chromosoomdefecten optreden in somatische cellen als gevolg van fouten die optreden tijdens mitose in de vroege stadia van ontogenese, kan dit leiden tot mozaïcisme. Bij deze personen zijn zowel cellen met een normaal X-chromosomale inhoud als cellen met X-chromosomale afwijkingen aanwezig.
In de jaren 1980 werd een cytogenetische techniek genaamd fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) ontwikkeld om specifieke nucleïnezuursequenties op metafase- en interfasechromosomen10,11 te visualiseren en te lokaliseren. Deze techniek maakt gebruik van fluorescerend gelabelde DNA-sondes om te binden aan een specifieke sequentie in het chromosoom, die vervolgens kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Tegenwoordig wordt FISH veel gebruikt als een klinisch diagnostisch hulpmiddel en wordt het beschouwd als de gouden standaard bij het detecteren van chromosomale afwijkingen10. Op het gebied van reproductieve geneeskunde is FISH-analyse op sperma gebruikt om inzicht te krijgen in het X-chromosomale gehalte van spermatozoa bij mannen met numerieke of structurele chromosomale afwijkingen in somatische cellen12,13,14. Deze studies toonden aan dat mannen met chromosomale afwijkingen meer kans hadden op een hogere frequentie van aneuploïde spermatozoa in hun sperma in vergelijking met mannen met normale karyotypen12,13,14.
In tegenstelling tot spermatozoa is er zeer weinig bekend over het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen (inclusief eicellen, granulosa / theca-cellen en stromale cellen) bij personen met een chromosomale aberratie, evenals de mogelijke gevolgen van aneuploïdie van deze cellen op hun voortplantingspotentieel. Een belangrijke reden voor de schaarse informatie over het karyotype van eierstokcellen in vergelijking met spermatozoa is het feit dat vrouwen een invasieve procedure moeten ondergaan, zoals een follikelpunctie of een operatie om eicellen of ovariële cortexweefsel te verkrijgen. Vrouwelijke gameten zijn daarom moeilijk te verkrijgen voor onderzoeksdoeleinden.
Momenteel wordt in Nederland een observationele interventiestudie uitgevoerd om de werkzaamheid van cryopreservatie van eierstokweefsel bij jonge vrouwen met TS15 te onderzoeken. Eén fragment van het ovariële cortexweefsel van de patiënt was beschikbaar om de X-chromosomale inhoud van de eierstokcellen te identificeren16,17. Als onderdeel van de studie werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van FISH van gedissocieerd ovariële cortexweefsel om te bepalen of chromosomale afwijkingen aanwezig zijn in eierstokcellen bij vrouwen met een chromosomale afwijking in niet-ovariële somatische cellen, zoals lymfocyten of buccale cellen. Daarnaast werd ook het effect van aneuploïdie in eierstokcellen op folliculogenese bepaald. Hiertoe werd een gevestigd FISH-protocol gewijzigd dat de analyse van histologische secties van ovariële cortexweefsel mogelijk maakt na kunstmatig geïnduceerde folliculogenese tijdens langdurige xenotransplantatie bij immuungecompromitteerde muizen. In deze studie presenteren we twee methoden op basis van FISH om het X-chromosomale gehalte in eierstokcellen in niet-geënt en geënt ovariële cortexweefsel bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen te bepalen, met als doel de basiswetenschap over dit onderwerp te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het TurnerFertility studieprotocol is goedgekeurd door de Centrale Commissie Onderzoek met Mensen (NL57738.000.16). In deze studie werd het ovariële cortexweefsel van 93 vrouwen met TS verkregen. Materialen waarvoor veiligheidsmaatregelen nodig zijn, staan vermeld in tabel 1.
Tabel 1: Veiligheidsmaatregelen.
| Materiaal | Gevaar | ||
| Azijnzuur | Ernstige brandwonden op de huid en irritatie van de luchtwegen | ||
| Collagenase | Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid | ||
| DAPI | Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid | ||
| DNase I | Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid | ||
| Ethanol | Ontvlambaar | ||
| Formaldehyde | Giftig na inademing, inname en huidcontact | ||
| Formamide (in fluorescentiesondes) |
Kan het ongeboren kind schaden | ||
| Liberase | Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid | ||
| Methanol | Licht ontvlambaar, giftig bij inademing, inslikken en huidcontact | ||
| Nonidet P40 | Irriterend voor de huid of ogen | ||
| Pepsine | Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid | ||
| Proteïnase K | Ademhalingsmoeilijkheden na inademing | ||
| Xyleen | Licht ontvlambaar, giftig na inademing en huidcontact. Vermijd contact met de ogen. | ||
Tabel 1: Materialen waarvoor veiligheidsmaatregelen nodig zijn.
1. FISH op geïsoleerde individuele ovariële cortexcellen
- Dissociatie van ovariële cortexweefsel om individuele cellen te verkrijgen
- Snijd het gecryopreserveerde/ontdooide ovariële cortexweefsel in kleine stukjes van ongeveer 1 mm x 1 mm x 1 mm met behulp van een scalpel.
- Enzymatisch verteren van de weefselfragmenten in 4 ml voorverwarmd (37 °C) L15-medium met 0,1 mg/ml weefseldissociatie-enzymmengsel, 10 μg/ml DNase I en 1 mg/ml collagenase I van C. histolyticum gedurende maximaal 75 minuten bij 37 °C. Pipetteer de verteringsmix elke 15 minuten op en neer.
- Stop de enzymatische spijsvertering door toevoeging van 4 ml koud L15 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Was het gedissocieerde weefsel eenmaal met 8 ml koud L15-medium door centrifugeren op 500 x g en resuspenderen in 500 μL L15-medium zonder vortexing om schade aan de cellen te voorkomen.
- Breng de celsuspensie met grotendeels individuele stromale cellen en kleine follikels (eicellen omgeven door een enkele laag granulosacellen) over naar een plastic petrischaal en onderzoek de celsuspensie onder een stereomicroscoop (100x vergroting).
- Pak de kleine follikels (<50 μm) handmatig op met behulp van een plastic pipet van 75 μm en breng de follikels over in een druppel L15-medium aangevuld met 10% FBS bij 4 °C om de aggregatie van follikels te voorkomen. Voer follikel pick-up uit voor een maximum van 30 minuten. Om de folliculaire celverspreiding voorafgaand aan FISH-analyse te verbeteren, brengt u de gezuiverde follikels over in een oplossing van 0,06% trypsine, 1 mg / ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 1 mg / ml glucose en incubeert u gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Verkrijg ovariële stromale cellen uit de cortexcelsuspensie met behulp van een plastic pipet van 75 μm, waarbij speciale zorg wordt besteed aan het voorkomen van besmetting met kleine follikels.
- FISH-analyse van individuele eierstokcellen
- Breng de behandelde ovariële follikels (aanbevolen n = 5-20) met trypsine/EDTA/glucose of stromale cellen (n > 1.000) over in druppeltjes van 5 μL van 0,15 mM KCl/15 μL dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) op een glaasje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Droog en fixeer de glaasjes gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) in 300 μL van 0,05 mM KCl/7,5% azijnzuur/22,5% methanol. Bedek de dia's met methanol/azijnzuur (3:1) gedurende 2 minuten bij RT om de fixatie te voltooien.
- Maak 20x standaard natriumcitraat (SSC) door 876 g natriumchloride en 441 g trinatriumcitraatdihydraat toe te voegen aan 5 L gedestilleerd water. Voeg vervolgens 100 ml van de 20x SSC toe aan 900 ml gedemineraliseerd (demi) water om 2x SSC te verkrijgen. Was het monster in 2x SSC bij 73 °C, bedek het met 100 μL 2% proteïnase K en sluit het af met een dekplaat. Incubeer de dia's gedurende 10 minuten bij 37 °C in het hybridisatiestation.
- Verwijder de afdeklaag en was de dia's gedurende 5 minuten in DPBS bij RT. Fixeer het monster gedurende 5 minuten met 1% formaldehyde bij RT. In dit stadium is het materiaal nog niet volledig bevestigd aan de glasplaten en mag het daarom niet op een schudplatform worden geplaatst.
- Was de dia's gedurende 5 minuten in DPBS bij RT, gevolgd door uitdroging in de daaropvolgende 70%, 80%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 2 minuten. Droog het gedehydrateerde monster aan de lucht en hybridiseer het met fluorescerend gelabelde sondes.
- Selecteer een centromeerspecifieke sonde voor chromosoom X en een andere chromosoomspecifieke centromere sonde als controle om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te bepalen. In dit geval worden centromeerspecifieke sondes voor chromosoom X (CEP X [DXZ1]) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumGreen en chromosoom 18 (CEP 18 [D18Z1]) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumOrange gebruikt.
- Voeg 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 en 18 μL van de hybridisatiebuffer toe aan het monster en sluit af met een coverslip die op de dia's is gelijmd om verdamping van de sonde tijdens hybridisatie te voorkomen. Breng de dia's over naar het hybridisatiestation voor denaturatie bij 73 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door hybridisatie tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 °C.
- Verwijder de afdekplaat en eventuele resterende lijm van de glijbaan na hybridisatie. Was de dia's in 0,4x SSC/0,3% Tween-20 op 72 °C gedurende 2 min, gevolgd door incubatie gedurende 1 min in 2x SSC/0,1% Tween-20 bij RT.
- Droog de dia's uit door opeenvolgende incubaties van 2 minuten in 70%, 80%, 90% en 100% ethanol en droog ze in het donker aan de lucht. Bedek de dia's met een bevestigingsmedium dat 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat. Bewaren bij -20 °C gedurende ten minste 10 minuten vóór analyse door middel van fluorescentiemicroscopie.
- Beeldvorming
- Onderzoek de signalen voor het X-chromosoom met een fluorescentiemicroscoop die is gekoppeld aan een beeldverwerkingssoftware.
- Selecteer eerst fluorochroom DAPI.
- Verkrijg een afbeelding door Nieuwe cel te selecteren > Live > Capture bij een vergroting van 630x. Er verschijnt een nieuw venster met de drempel. Stel de blauwe balk van de drempel in op 0 om de achtergrond te minimaliseren en de rode balk op maximaal (255) om de signalen helderder te maken. Klik op Accepteren.
- Er verschijnt een nieuw venster met verbetering met een suggestie voor donkerder/helderder (12), straal (3) en diepte (1). Gebruik de voorgestelde waarden of pas ze aan als u niet tevreden bent.
- Selecteer ten tweede fluorochroom SpectrumOrange en klik op Capture.
- Stel de blauwe balk van de drempel in op 0 om de achtergrond te minimaliseren en de rode balk op maximaal (255) om de signalen helderder te maken. Klik op Accepteren.
- Het venster met verbetering wordt weergegeven met een suggestie voor donkerder / helderder (-11), straal (2,7) en diepte (0,6). Gebruik de voorgestelde waarden of pas ze aan als u niet tevreden bent.
- Selecteer ten slotte fluorochroom SpectrumGreen en klik op Capture.
- Stel de blauwe balk van de drempel in op 0 om de achtergrond te minimaliseren en de rode balk op maximaal (255) om de signalen helderder te maken. Klik op Accepteren.
- Het venster met verbetering wordt weergegeven met een suggestie voor donkerder/helderder (0), straal (3) en diepte (0). Gebruik de voorgestelde waarden of pas deze aan als u niet tevreden bent. Sla de afbeelding op in een nieuw gemaakt bestand.
OPMERKING: Somatische cellen werden alleen geëvalueerd wanneer twee signalen van het controlechromosoom 18 zichtbaar waren. In de meeste eicellen kon slechts één signaal voor elk chromosoom worden gedetecteerd.
- Selecteer eerst fluorochroom DAPI.
- Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C na analyse om verlies van signalen te voorkomen.
- Onderzoek de signalen voor het X-chromosoom met een fluorescentiemicroscoop die is gekoppeld aan een beeldverwerkingssoftware.
2. FISH op paraffinesecties van geënt ovariële cortexweefsel
OPMERKING: Eén fragment van gecryopreserveerd/ontdooid ovariële cortexweefsel van 18 vrouwtjes met TS werd gedurende 5 maanden xenogetransplanteerd in ernstige gecombineerde immunodeficiënte (SCID) muizen. De procedure van xenografting is eerder beschreven en werd uitgevoerd aan de Université Catholique de Louvain (Brussel, België) volgens de lokale richtlijnen van het Comité voor dieronderzoek inzake dierenwelzijn (referentie 2014/UCL/MD/007)18,19.
- Het selecteren van secties van xenogetransplanteerd ovariële cortexweefsel dat follikels bevat
- Fixeer xenogetransplanteerd ovariële cortexweefsel in 4% formaldehyde en sluit het weefsel in paraffine in. Snijd de blokken bij met een scalpel om extra paraffine te verwijderen en snijd het paraffineblok op een rotatiemicrotoom tot 4 μm dikte.
- Selecteer elke zevende sectie van het paraffinelint voor hematoxyline en eosine (HE) kleuring om te bepalen welke secties follikels bevatten. Plaats de sectie in een waterbad bij 40-45 °C en monteer ze op immunohistochemische microscoopglaasjes.
- Deparaffinisatie en HE-kleuring
- Zet de dia's 10 minuten op een fornuis bij 60 °C en dompel de dia's daarna 5 minuten onder in 100% xyleen. Het is niet nodig om de dia's direct op de kachel te plaatsen. Hydrateer de secties gedurende 15 s in 100% ethanol, gevolgd door 2 x 15 s in 96% ethanol. Spoel de glijbanen af in leidingwater gedurende 2 min.
- Bevlek de dia's gedurende 10 minuten in hematoxyline en spoel de dia's daarna kort af in leidingwater. Dompel de dia's kort onder in een bicarbonaatoplossing (100 g magnesiumsulfaat en 10 g natriumbicarbonaat in 5 L gedestilleerd water). Spoel de glijbanen af in leidingwater gedurende 5 min.
- Counter de dia's met eosine gedurende 4 minuten en droog de dia's drie keer uit met 100% ethanol, gevolgd door xyleen. Bedek de HE-vlekken op de dia's en evalueer de HE-secties onder een lichtmicroscoop om de secties met follikels (100x vergroting) te selecteren.
- Voorbehandeling en hybridisatie van paraffinesecties voor DNA FISH
- Selecteer nieuwe secties die vóór of na de sectie liggen die follikels van het paraffinelint bevat. Monteer een sectie op een glazen dia. Droog de paraffinesecties minstens 45 minuten op een fornuis op 56 °C. Het is niet nodig om de dia's direct op de kachel te plaatsen.
- Deparaffineer de secties in xyleen gedurende 10 minuten. Dompel de dia's onder in 99,5% ethanol en spoel ze 5 minuten af in leidingwater. Voorbehandel de dia's met de doeloplossing (lage pH) gedurende 10 minuten bij 96 °C. Spoel na het afkoelen de glaasjes af in gedestilleerd water.
- Behandel de dia's gedurende 5 minuten met 0,01 M zoutzuur, gevolgd door pepsinevertering (200 E/ml) gedurende 15 minuten bij 37 °C. Spoel de glaasjes opnieuw af in 0,01 M zoutzuur en vervolgens in PBS.
- Fixeer de glaasjes gedurende 5 minuten in 1% formaldehyde/PBS. Spoel de dia's kort af in PBS en vervolgens opnieuw in demi-water. Droog de glaasjes uit in 99,5% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.
- Selecteer een centromeerspecifieke sonde voor chromosoom X en een andere chromosoomspecifieke centromere sonde als controle om het X-chromosomale gehalte van granulosacellen te bepalen. Hier wordt chromosoom 18 als controle gebruikt.
- Breng 5 μL sonde CEP 18 (D18Z1) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumGreen en sonde CEP X (DXZ1) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumRed aan op de voorbehandelde dia's. Breng een coverslip aan en sluit het gebied af met fotolijm. Plaats de dia's in een veredelaar voor denaturatie bij 80 °C gedurende 10 minuten en hybridisatie 's nachts bij 37 °C.
- Spoel de dia's de volgende dag 5 min af in 2x SSC bij 42 °C, gevolgd door een spoeling van 2 min en 1 min in 0,3% Nonidet P40 bij 73 °C. Ververs de 2x SSC en spoel de dia's opnieuw gedurende 5 minuten af op kamertemperatuur. Dek de cuvette af zodat de secties in het donker worden gehouden.
- Spoel de glaasjes kort af in gedestilleerd water. Droog de glaasjes uit in 99,5% ethanol en laat ze weer aan de lucht drogen. Monteer ten slotte de dia's met een oplossing die DAPI en montagemedium bevat.
- Beeldvorming
- Analyseer de resultaten onder een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 630x. Open de beeldverwerkingssoftware op de computer. Selecteer FISH als profiel.
- Controleer of de DAPI-emissie is ingesteld op 431 nm en de excitatie op 359 nm, Texas red-emissie op 613 nm en excitatie op 595 nm, en FITC-emissie op 519 nm en excitatie op 495 nm.
- Verkrijg een afbeelding door Live > Eén afbeelding vastleggen te selecteren. Optimaliseer de beeldkwaliteit door de belichting en versterking aan te passen door de schuifregelaar Belichting en de schuifregelaar Versterking in het menu Afbeelding aan de linkerkant te verplaatsen (bijvoorbeeld belichting: 212 ms en versterking: 7,9). De benodigde belichting en versterking kan per beeld verschillen; Observeer de veranderingen tijdens dit proces om een geoptimaliseerd beeld te verkrijgen. Sla de afbeelding op in een nieuw gemaakt bestand.
- Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C na analyse om verlies van signalen te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISH op geïsoleerde eierstokcellen voorafgaand aan het enten
Gecryopreserveerd ovariële cortexweefsel van vrouwen met 45,X/46,XX (patiënt A) of 45,X/46,XX/47,XXX (patiënt B) TS werden gebruikt om de resultaten met behulp van dit protocol te illustreren. Bij patiënt A had 50% van de lymfocyten een 45,X karyotype en 50% 46,XX. Bij patiënt B was 38% van de lymfocyten 45,X, 28% 46,XX en 34% 47,XXX. Centromeerspecifieke sondes voor chromosoom X (groen) en chromosoom 18 als controle (rood) werden gebruikt om het X-chromosomale gehalte van individuele granulosacellen, stromale cellen en eicellen geïsoleerd uit ovariële cortexweefsel van TS-patiënten te bepalen zonder voorafgaande xenotransplantatie (figuur 1).
Figuur 1: FISH-analyse van geïsoleerde eierstokcellen uit ovariële cortexweefsel voorafgaand aan transplantatie. Oöcyten (pijlpunten) en granulosacellen van enkele primordiale follikels (A, B) en (C, D) de omliggende stromale cellen werden geanalyseerd met fluorescerende specifieke sondes voor chromosoom X (groene signalen) en controlechromosoom 18 (rode signalen). Witte pijlen geven 45,X cellijnen aan, gele pijlen geven 46,XX cellijnen aan en rode pijlen geven 47,XXX cellijnen aan. Niet alle fluorescerende signalen bevinden zich in hetzelfde scherpstelvlak. Staafjes vertegenwoordigen 10 μm. De vergroting van FISH-signalen is ingesteld op 630x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verschillen tussen individuele primordiale follikels die vóór FISH met en zonder trypsine werden behandeld, zijn weergegeven in figuur 2. Door trypsine te gebruiken voorafgaand aan de FISH-analyse, werden de granulosacelmassa en eicellen minder samengeklonterd, waardoor de analyse van het X-chromosomale gehalte van individuele granulosacellen en eicellen mogelijk was. Het DNA van eicellen kan gemakkelijk worden onderscheiden van dat van de omliggende granulosacellen vanwege de onregelmatige vorm, grootte en diffuse verschijning van DNA uit de eicellen. Bovendien wordt slechts één sterk FISH-signaal voor elk chromosoom waargenomen in de eicellen van kleine follikels, vanwege de nabijheid van de vier zusterchromatiden in deze cellen. Het X-chromosomale gehalte van eicellen kan worden bepaald met behulp van de oppervlakteverhouding van het FISH-signaal voor chromosoom X tot die van chromosoom 18.
Figuur 2: Kleine follikels behandeld met en zonder trypsine voorafgaand aan FISH. (A) Enzymatische vertering van ovariële cortexweefsel resulteerde in een suspensie van grotendeels gedissocieerde cellen, maar verliet de primordiale follikels, bestaande uit een intacte eicel omgeven door een enkele laag granulosacellen (pijlpunten in paneel A). (B) Kleine follikels werden met de hand uit de celsuspensie geplukt, maar leverden problemen op om signalen na FISH te interpreteren als gevolg van samenklontering van de granulosacellen (C). (D,E) Extra vertering van de geïsoleerde follikels met trypsine voorafgaand aan FISH resulteerde in individuele granulosacellen om samen te trekken tot een bolvormige morfologie op het oppervlak van de follikels en hadden meer kans om zich te distantiëren van de follikel om toegankelijk te worden voor FISH-analyse. Van eicellen afgeleide FISH-signalen worden aangegeven met pijlen. Zwarte balken vertegenwoordigen 100 μm en witte balken vertegenwoordigen 10 μm. De vergroting van FISH-signalen is ingesteld op 630x. Paneel D is gereproduceerd met toestemming van Peek et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FISH-analyse van granulosacellen op paraffinesecties van geënt ovariële cortexweefsel
Secundaire en antrale follikels bleken minder gevoelig te zijn voor enzymatische spijsvertering, waardoor de eerder beschreven methode van weefseldissociatie om individuele eierstokcellen te verkrijgen niet geschikt is voor het kweken van follikels in het eierstokweefsel na langdurige xenotransplantatie. Daarom werd het FISH-protocol geoptimaliseerd met behulp van histologische secties van 4 μm om het X-chromosomale gehalte van granulosacellen van secundaire en antrale follikels in ovariële cortexweefsel na transplantatie te bepalen (figuur 3). In deze setting is het onwaarschijnlijk dat het FISH-signaal van het X-chromosoom of het controlechromosoom in eicellen zou worden opgevangen in een enkele sectie van 4 μm, vanwege de grote diameter van eicellen in de groeiende follikels.
Figuur 3: Histologische en FISH-kleuring van weefselsecties van de ovariële cortex na xenotransplantatie. (A,B) Hematoxyline/eosinekleuring toonde morfologisch normale secundaire en antrale follikels in ovariële cortexweefsel na 5 maanden xenografting. (C,D) Het X-chromosomale gehalte van granulosacellen van deze follikels werd bepaald door FISH-analyse. In deze figuur is chromosoom X in het rood weergegeven en chromosoom 18 in het groen. De staaf in paneel A vertegenwoordigt 50 μm, de staaf in paneel B vertegenwoordigt 20 μm en de staven in paneel C en D vertegenwoordigen 10 μm. De vergroting van FISH-signalen is ingesteld op 630x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Als eerste stap werden experimenten met verschillende fixatietechnieken van de weefsels uitgevoerd om te bepalen welke methode resulteert in de beste FISH-signalen. FISH-analyse werd uitgevoerd op getransplanteerd weefsel dat was gefixeerd in zowel Bouin's oplossing en vervolgens werd ondergedompeld in 4% formaldehyde, als op getransplanteerd weefsel dat alleen in 4% formaldehyde was gefixeerd. Geënt weefsel dat eerst in Bouin's was gefixeerd, vertoonde een groene waas op het beeld, waardoor het moeilijk was om het aantal FISH-signalen nauwkeurig te tellen (figuur 4).
Figuur 4: Geënt ovariële cortexweefsel gefixeerd in Bouin's oplossing en formaldehyde alleen. (A) Het fixeren van geënt ovariële cortexweefsel in de oplossing van Bouin resulteerde in wazige en grotendeels verduisterde fluorescerende signalen in folliculaire cellen als gevolg van een groene waas. (B) Ovariële cortexweefsel dat was gefixeerd in formaldehyde leverde alleen uitstekende fluorescerende signalen op die gemakkelijk te interpreteren waren. Staafjes vertegenwoordigen 10 μm. De vergroting van FISH-signalen is ingesteld op 630x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om het X-chromosomale gehalte van granulosacellen van follikels in histologische secties te bepalen, is het niet mogelijk om eenvoudig de FISH-signalen van granulosacellen te tellen. Een deel van de chromosomen van een individuele granulosacel kan verloren gaan in een bepaalde histologische sectie, als gevolg van sectie van het weefsel. Daarom is het noodzakelijk om eerst het percentage FISH-signalen te bepalen dat verloren gaat als gevolg van sectie voordat uiteindelijk het verlies van X-chromosomale inhoud van de granulosacelpopulatie wordt bepaald als gevolg van aneuploïdie in nieuw gevormde secundaire en antrale follikels na enting van het weefsel.
Het percentage verloren FISH-signalen als gevolg van doorsnede kan worden berekend door het aantal FISH-signalen per granulosacel van het niet-aneuploïde controlechromosoom 18 te bepalen. De verwachting is dat hetzelfde percentage van het X-chromosoom verloren gaat door doorsnede. Elke extra vermindering van het aantal X-chromosoom FISH-signalen in de granulosacelpopulatie is te wijten aan aneuploïdie. Het gebruik van FISH-signalen van een controlechromosoom om X-chromosomaal verlies als gevolg van aneuploïdie te bepalen, vereist echter dat de detectiegevoeligheid van de FISH-signalen van het X-chromosoom en het controlechromosoom zeer vergelijkbaar zijn. De detectiegevoeligheid van beide FISH-sondes in granulosacellen van groeiende follikels in histologische secties van niet-aneuploïde 46,XX-individuen werd daarom bepaald. Wanneer de verhouding van chromosoom X/controlechromosoom FISH-signalen dicht bij 1 ligt, kan worden aangenomen dat de detectiegevoeligheid van beide sondes inderdaad zeer vergelijkbaar is, en dat de FISH-sondes dus kunnen worden gebruikt om het niveau van aneuploïdie in de granulosacelpopulatie van groeiende follikels in histologische secties van eierstokweefsel na xenotransplantatie te bepalen.
Voorbeeld
Bij het analyseren van het aantal chromosoom 18 signalen in 130 granulosacellen van een follikel uit een eierstok van een 46,XX individu, wordt verwacht dat er 260 signalen aanwezig zijn. In een sectie van 4 μm van deze cellen werden echter slechts 204 chromosoom 18-signalen waargenomen. Dit geeft aan dat 21,5% van de signalen verloren gaat door doorsnede ((260-204)/260 x 100 = 21,5%). Het aantal chromosoom 18 signalen per granulosacel wordt door doorsnede dus teruggebracht tot 204/130 = 1,57.
Vervolgens wordt het aantal X-chromosomen in granulosacellen van een antrale follikel na enting in eierstokweefsel van een vrouw met TS geanalyseerd. In totaal werden 191 signalen voor chromosoom X en 199 signalen voor chromosoom 18 geteld. Het aantal granulosacellen kan worden bepaald door het totale aantal signalen voor chromosoom 18 te delen door het aantal chromosoom 18-signalen per granulosacel (199/1,57 = 127 granulosacellen). Ten slotte kan het percentage 45,X granulosacellen worden bepaald door het verschil in chromosoom 18- en chromosoom X-signalen te delen door het aantal granulosacellen (d.w.z. [199-191]/127 x 100 = 6% van de granulosacellen zijn 45,X, en 94% van deze cellen zijn 46, XX).
Het is opmerkelijk dat bij patiënten met een 47,XXX-cellijn alleen het minimumpercentage granulosacellen met een 47,XXX karyotype kan worden bepaald, omdat een mix van 45,X en 47,XXX granulosacellen hetzelfde aantal X-chromosoomsignalen heeft als 46,XX granulosacellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FISH-analyse is een bekende techniek om X-chromosomale afwijkingen in lymfocyten of buccale cellen van zowel mannen als vrouwen te detecteren10. Verschillende studies hebben FISH beschreven op gameten van mannen met X-chromosomale afwijkingen, maar gedetailleerde informatie verkregen door FISH over eierstokcellen van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen ontbreekt nogsteeds 14. Dit artikel presenteert nieuwe methoden op basis van FISH om te bepalen of aneuploïdie aanwezig is in de eierstokcellen van niet-geënt en geënt ovariële cortexweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.
De belangrijkste uitdaging van het protocol voor de isolatie van individuele eierstokcellen in niet-geënt ovariële cortexweefsel ligt in de enzymatische vertering van het weefsel, wat vooraf enige oefening vereist. Om nauwkeurige FISH-signalen van voldoende eierstokcellen te verkrijgen, is het belangrijk om de stappen met betrekking tot enzymatische spijsvertering, incubatietijden en aangegeven temperaturen strikt te volgen. Afwijken van het protocol kan een aanzienlijk verlies van eierstokcellen tijdens het proces veroorzaken, en dit moet vooral worden vermeden bij patiënten die al een lage ovariële reserve hebben. Een andere cruciale stap in deze methode is om de gezuiverde primordiale follikels te behandelen met trypsine om te voorkomen dat eicellen en de granulosa-celmassa klonteren, wat de analyse van individuele cellen uitsluit. Zonder behandeling met trypsine is het aantal individuele granulosacellen dat betrouwbaar kan worden geanalyseerd door FISH ernstig verminderd.
De FISH-analyse op ovariële cortexweefsel dat na langdurige transplantatie wordt opgehaald, vereist een andere techniek, omdat alleen kleine follikels voldoende vatbaar bleken te zijn voor de enzymatische spijsvertering die nodig is om individuele eierstokcellen te verkrijgen. Bovendien, vergelijkbaar met autotransplantatie van ovariële cortexweefsel, raken veel follikels verloren na transplantatie als gevolg van hypoxie en een gebrek aan voedingsstoffen voordat het transplantaat voldoende wordt gerevasculariseerd door de gastheer20. Het aantal follikels na enten zal naar verwachting dan ook aanzienlijk lager zijn dan voor het enten. Voor deze FISH-techniek die wordt gebruikt voor histologische secties, is het belangrijk om het getransplanteerde weefsel alleen in 4% formaldehyde te fixeren om optimale FISH-signalen te verkrijgen. Fixatie van ovariële cortexweefsel in Bouin's fixatief wordt routinematig gebruikt in het laboratorium, en hoewel dit uitstekende resultaten geeft in combinatie met standaard HE-kleuring, leidt het fixeren van weefsel met Bouin's voorafgaand aan FISH tot zwakke en wazige fluorescerende signalen die moeilijk te interpreteren zijn.
Hoewel dit protocol bewezen succesvol is bij het bepalen van het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen, heeft het nog steeds enkele beperkingen. Een beperking is dat deze methoden alleen kunnen worden gebruikt om de eierstokcellen van vrouwen met numerieke afwijkingen te analyseren. Numerieke aberraties kunnen worden gedetecteerd met behulp van sondes gericht op repetitieve sequenties21. Deze sondes hybridiseren meerdere herhalende basenpaarsequenties in het centromeergebied, wat resulteert in sterke hybridisatiesignalen. Structurele aberraties kunnen daarentegen alleen worden gedetecteerd door sondes te gebruiken tegen unieke afzonderlijke sequenties. Deze sondes hybridiseren tot sequenties die slechts één keer voorkomen in het haploïde genoom, wat resulteert in een aanzienlijk minder intens FISH-signaal in vergelijking met numerieke aberraties. Vanwege deze relatief zwakke FISH-signalen is het moeilijk om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen bij vrouwen met structurele afwijkingen goed te bepalen.
Ten tweede zijn FISH-signalen van eicellen van kleine follikels in niet-geënt weefsel moeilijk te analyseren, vanwege de nabijheid van de vier zusterchromatiden in de profase van meiose I22. Er zal slechts één sterk hybridisatiesignaal aanwezig zijn in de eicellen en daarom is het niet mogelijk om eenvoudig het aantal signalen in de eicellen te tellen om het X-chromosomale gehalte te bepalen. In plaats daarvan moet de oppervlakteverhouding van chromosoom X en 18 FISH-signalen worden gebruikt om het X-chromosomale gehalte in deze cellen te bepalen. Dit kan alleen betrouwbaar worden vastgesteld als de FISH-signalen in de eicellen duidelijk aanwezig zijn.
Bovendien kan FISH op getransplanteerd weefsel alleen worden gebruikt om het X-chromosomale gehalte van granulosacellen uit secundaire en antrale follikels te bepalen, omdat kleine follikels in histologische secties van getransplanteerd weefsel slechts een paar granulosacellen hebben die goed kunnen worden geanalyseerd. Bovendien kan het X-chromosomale gehalte van eicellen niet nauwkeurig worden bepaald met deze methode vanwege de grote diameter van de eicellen.
Ten slotte blijft het een uitdaging om vrouwelijke gameten te verkrijgen in vergelijking met mannelijke gameten, omdat invasieve chirurgie vereist is om eierstokcellen of ovariële cortexweefsel te verkrijgen. Daarom zijn deze methoden het meest waarschijnlijk toegepast in een onderzoeksomgeving.
Kortom, FISH-analyse van eierstokcellen van niet-geënt en geënt ovariële cortexweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen is een unieke en nuttige techniek om inzicht te krijgen in het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen in deze specifieke groep. Deze technieken tonen aan dat cryopreservatie van ovariële cortexweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen mogelijk is, en dat gecryopreserveerde primordiale follikels in staat zijn om uit te groeien tot secundaire en antrale follikels. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat beide methoden bedoeld zijn om toekomstig onderzoek bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen te vergemakkelijken en niet zijn ontworpen om te worden gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel om reproductieve uitkomsten van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen in de klinische praktijk te screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef en Milan Intezar voor hun expertise en technische assistentie. Financieringsbronnen: Merck Serono (A16-1395), Goodlife en Ferring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
