토끼의 허혈 및 재관류 손상 모델
Summary
본 연구는 생존 사례의 경우 좌측 미니 흉곽 절개술 또는 비생존 사례의 경우 정중선 흉골 절개술을 사용하여 토끼의 급성 국소 심근 허혈 및 재관류 손상의 재현성이 높은 동물 모델을 보여줍니다.
Abstract
여기의 프로토콜은 비생존 및 생존 실험을 위해 토끼에서 제 자리 급성 국소 심근 허혈을 유도하기 위한 간단하고 복제성이 높은 방법론을 제공합니다. 뉴질랜드 성충 토끼는 아트로핀, 아세프로마진, 부토르파놀, 이소플루란으로 진정제를 투여합니다. 동물을 삽관하고 기계 환기 장치를 놓습니다. 정맥 카테터를 변두리 귀 정맥에 삽입하여 약물을 주입합니다. 동물은 헤파린, 리도카인 및 젖산 링거 용액으로 사전 투여됩니다. 혈압 모니터링을 위해 동맥 라인 접근을 위해 경동맥 절단술을 시행합니다. 선택된 생리학적 및 기계적 매개변수는 지속적인 실시간 분석을 통해 모니터링되고 기록됩니다.
동물을 진정시키고 완전히 마취한 상태에서 네 번째 늑간 공간 작은 좌측 흉곽 절개술(생존) 또는 정중선 흉골 절개술(비생존)을 수행합니다. 심낭이 열리고 좌측 전방 하행(LAD) 동맥이 위치합니다.
폴리프로필렌 봉합사는 LAD 동맥의 두 번째 또는 세 번째 대각선 가지 주위를 통과하고 폴리프로필렌 필라멘트는 작은 비닐 튜브를 통해 나사산을 만들어 올가미를 형성합니다. 동물은 30 분 동안 국소 허혈을 겪으며, 올가미를 조여서 LAD를 폐색함으로써 달성됩니다. 심근 허혈은 심외막의 국소 청색증에 의해 육안으로 확인됩니다. 국소 허혈 후에는 합대가 느슨해지고 심장이 다시 관류됩니다.
생존 및 비생존 실험 모두에서 심근 기능은 분수 단축의 심장 초음파(ECHO) 측정을 통해 평가할 수 있습니다. 비생존 연구의 경우, 정점으로 삽입된 좌심실(LV) 카테터를 사용하여 허혈성 부위 및 좌심실 발달 압력(LVDP)에 이식된 3개의 디지털 압전 초음파 프로브를 사용하여 수집된 초음파 측정 데이터를 지속적으로 획득하여 각각 국소 및 전체 심근 기능을 평가할 수 있습니다.
생존 연구의 경우 절개 부위를 봉합하고 흉막 공기 배출을 위해 왼쪽 바늘 흉강천자를 시행하고 수술 후 통증 조절을 달성합니다.
Introduction
심혈관 질환은 전 세계 주요 사망 원인이며 매년 1,800만 명 이상의 사망에 기여합니다 1,2,3. 급성 심근경색(MI)은 혈전이나 죽상종성 플라크 조각이 관상동맥의 혈류를 차단할 때 발생하는 일반적인 의료 응급 상황입니다. 이것은 동맥이 관류되는 영역에서 국소 심근 허혈을 유발합니다.
본 연구는 비생존 및 생존 실험을 위한 토끼 모델에서 제자리 급성 국소 심근 허혈을 생성하기 위해 간단하고 신뢰할 수 있는 방법론을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법의 초기 목표는 심근 괴사를 조절하고 허혈성 사건 후 허혈성 심장 기능을 증가시키는 미토콘드리아 이식의 효과를 평가하는 것이었습니다. 이전 연구에서는 허혈이 시작되고 산소 공급이 감소한 후 미토콘드리아 변화가 발생하고 고에너지 인산염 수치가 급격히 감소하여 심장 에너지 저장량이 급격히 감소하는 것으로 나타났습니다4. 연구자들은 약리학적 중재 및/또는 절차적 기술을 사용하여 허혈 후 기능을 개선하고 심근 조직 괴사를 줄이려고 시도했지만 이러한 기술은 제한된 심장 보호를 제공하고 미토콘드리아 손상 및 기능 장애에 미치는 영향이 최소화되었습니다 5,6,7. 우리 연구팀과 다른 연구팀은 이전에 미토콘드리아 손상이 주로 허혈 중에 발생하며, 재관류 중 미토콘드리아 호흡 기능이 보존됨에 따라 수축 회복이 향상되고 심근경색 크기가 감소할 수 있음을 보여주었습니다 8,9,10. 따라서 재관류 전에 허혈의 영향을 받지 않는 조직에서 허혈 부위로 미토콘드리아 이식을 하면 심근괴사를 줄이고 심근 기능을 향상시킬 수 있는 대안이 될 것이라는 가설을 세웠다. 여기에서는 이 이론을 테스트하는 데 사용된 프로토콜과 초기 연구 분석에서 얻은 대표 결과를 자세히 설명합니다.
또한 여러 연구자들은 심근 허혈 재관류 손상의 영향을 정의하고 적절한 치료 개입을 확립하는 데 필수적인 다른 주제에 중점을 두었습니다. 이러한 연구 분야 중 하나는 사전 조건화입니다. 심근 허혈성 전처리는 짧은 허혈성 스트레스에 의해 활성화되는 심장 보호 메커니즘으로, 이후 장기간의 허혈 에피소드 동안 심장 세포 괴사 속도를 감소시킵니다. 이러한 메커니즘은 저산소증 또는 관상 동맥 폐색에 의해 활성화될 수 있습니다. Mandel 등은 저산소-고산소 전처리가 산화질소 대사 산물의 균형을 유지하고, 엔도텔린-1 과잉 생산을 감소시키며, 장기 보호를 지원하는 데 도움이 된다는 것을 입증했습니다11. 또한, 원격 허혈성 전처리(remote ischemic preconditioning)의 개념, 즉 단일 장기 전처리가 전신적 보호를 제공하는 현상이 연구되었습니다. Ali 등은 선택적 개방 복부 대동맥류 복원술을 받는 환자에서 자극 역할을 하기 위해 총장골동맥을 간헐적으로 교차 클램핑하여 수행하는 원격 전처리가 수술 후 심근 손상, 심근 경색 및 신장 장애의 발생률을 감소시킨다는 것을 발견했습니다12.
토끼 모델은 다른 종의 모델에 비해 잠재적인 이점을 제공하며 부정맥 유도, 전역 및 지역 허혈 모델, 심장 수축 연구 등 수십 년 동안 다양한 시나리오에서 사용되어 왔습니다13,14,15. 토끼의 심장은 개나 돼지의 심장보다 작지만, 훨씬 저렴한 비용으로 쉽게 수술을 할 수 있을 만큼 충분히 크다13. 토끼 심장은 인간의 심장과 매우 유사하기 때문에 자주 사용됩니다. 실제로, 그것은 비슷한 신진 대사 속도를 가지고, β-myosin 중쇄를 발현하고, 중요한 심근 크산틴 산화 효소16을 부족합니다. 국소 심근 허혈을 유도하기 위해 본원에 기술된 기술은 간단하고, 반복 가능하며, 비용 효율적이다. 이 방법은 전신 허혈이 아닌 국소 허혈만 유도되고 필요한 재료가 전문화되지 않기 때문에 비생존 및 생존 사례를 모두 허용합니다. 두 가지 다른 수술 접근법(즉, 흉골 절개술 및 미니 개흉술)을 활용할 수 있으므로 연구 설계 측면에서 작업자와 실험 프로토콜에 더 많은 자유를 제공할 수 있습니다. 또한 이 시술은 심폐 우회술을 사용할 필요가 없습니다. 이러한 맥락에서, 관상동맥 우회술에 대한 최소 침습적 접근법은 다혈관혈관재생술이 필요한 환자들에게 가치 있는 대안이 되었다17,18. 이 모델은 이러한 접근 방식의 차이점을 연구하고 외과 수련의를 위한 동물 기반 학습 도구를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 모델을 이용하여 심장 카테터 삽입을 수행하는 것은 생리학적 연구 및/또는 수술 훈련에 유용할 수 있다.
우리의 모델은 국소 심근 허혈을 유도하고 이후 경색 크기, 심근 기능 및 세포 변화를 측정하는 것이 중요한 응용 분야에 대한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜을 통해 세포 소기관의 내재화, 산소 소비, 고에너지 인산염 합성, 사이토카인 매개체 및 단백질체 경로의 유도를 조사하여 세포 기능 및 허혈에 대한 적응 및 제안된 치료 개입(즉, 미토콘드리아 이식)의 여러 마커를 평가할 수 있었습니다. 이러한 결과는 심근 에너지, 세포 생존력 및 심장 기능을 보존하는 데 중요하며 허혈 재관류 손상 후 심장 보호 기술을 객관적으로 평가할 수 있습니다. 이 모델은 허혈성 심근 병리학 및 회복 분야에서 유사한 생물학적 경로와 대안을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 목표는 비생존 및 생존 실험을 위해 토끼에서 제자리 급성 국소 심근 허혈을 유도하기 위한 재현성이 높은 방법론을 제공하는 것입니다. 이 모델은 높은 생존율, 낮은 수술 중 사망률, 최소 이환율을 갖는 방법론을 제공한다19. 급성 국소 심근 허혈에 대한 다른 모델들은 방사성 표지 물질, 조영제, 자기 공명 영상, 또는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 기술되었다20,21,22. 당사의 프로토콜은 비용 효율적이고 일관되게 재현 가능하며 기술 요구가 적기 때문에 수술 전문 지식이 없는 연구자가 수행할 수 있는 신뢰할 수 있고 간단한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 좌측 미니 흉곽 절개술을 사용하는 생존 프로젝트 또는 정중선 흉골 절개술을 사용하는 비생존 모델을 수용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 프로토콜은 토끼에서 급성 국소 심근 허혈을 수행하기 위한 신뢰할 수 있는 방법론을 보여줍니다. 좌측 미니 개흉술 접근법은 절개 및 관련 통증을 최소화해야 하는 생존 사례에 이상적입니다. 중요한 것은 발관 전에는 이뇨 요법이 필요하지 않았으며, 비생존군에서는 수술 중 사망률이 없었고, 생존군에서는 수술 후 4주에 사망률이 없었다는 점이다. 프로토콜의 설계에 생존이 불가능한 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜이 사용된 원래 연구는 National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL-103642 및 HL-088206의 지원을 받았습니다
Materials
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
Riferimenti
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