Tavşanlarda İskemi ve Reperfüzyon Hasarı Modeli
Summary
Bu çalışma, sağkalım vakaları için sol mini torakotomi veya sağkalım dışı vakalar için orta hat sternotomi kullanan tavşanlarda akut bölgesel miyokardiyal iskemi ve reperfüzyon hasarının yüksek oranda tekrarlanabilir bir hayvan modelini göstermektedir.
Abstract
Buradaki protokol, hayatta kalma ve sağkalım deneyleri için tavşanda in situ akut bölgesel miyokard iskemiyi indüklemek için basit, oldukça tekrarlanabilir bir metodoloji sağlar. Yeni Zelanda Beyaz yetişkin tavşanı atropin, asepromazin, butorphanol ve izofluran ile yatıştırılır. Hayvan entübe edilir ve mekanik ventilasyona yerleştirilir. İlaçların infüzyonu için marjinal kulak damarına intravenöz bir kateter yerleştirilir. Hayvan, heparin, lidokain ve laktasyonlu Ringer çözeltisi ile önceden ilaçlanır. Kan basıncının izlenmesi için arteriyel hat erişimi elde etmek için bir karotis kesimi yapılır. Seçilen fizyolojik ve mekanik parametreler sürekli gerçek zamanlı analizlerle izlenir ve kaydedilir.
Hayvan sakinleştirilip tamamen uyuşturulduğunda, dördüncü bir interkostal boşluk küçük sol torakotomi (sağkalım) veya orta hat sternotomi (sağkalım) yapılır. Perikard açılır ve sol ön inen (LAD) arter bulunur.
LAD arterinin ikinci veya üçüncü diyagonal dalının etrafından bir polipropilen sütür geçirilir ve polipropilen filament küçük bir vinil tüpten geçirilerek bir tuzak oluşturulur. Hayvan, tuzağı sıkarak LAD’yi tıkayarak elde edilen 30 dakikalık bölgesel iskemiye maruz bırakılır. Miyokardiyal iskemi, epikardın bölgesel siyanozu ile görsel olarak doğrulanır. Bölgesel iskemiyi takiben bağ gevşetilir ve kalbin yeniden perfüze olmasına izin verilir.
Hem sağkalım hem de sağkalım dışı deneyler için, miyokardiyal fonksiyon, fraksiyonel kısalmanın ekokardiyografi (EKO) ölçümü ile değerlendirilebilir. Sağkalım dışı çalışmalar için, iskemik alana implante edilen üç dijital piezoelektrik ultrasonik prob ve apikal olarak yerleştirilmiş bir sol ventrikül (LV) kateteri kullanılarak sol ventrikül geliştirilmiş basınç (LVDP) kullanılarak toplanan sonomikrometriden elde edilen veriler, sırasıyla bölgesel ve global miyokardiyal fonksiyonu değerlendirmek için sürekli olarak elde edilebilir.
Sağkalım çalışmaları için kesi kapatılır, plevral hava tahliyesi için sol iğne torasentez yapılır ve ameliyat sonrası ağrı kontrolü sağlanır.
Introduction
Kardiyovasküler hastalıklar dünyada önde gelen ölüm nedenidir ve her yıl 18 milyondan fazla ölüme katkıda bulunmaktadır 1,2,3. Akut miyokard enfarktüsü (MI), bir kan pıhtısı veya bir parça ateromatöz plak koroner arterin kan akışını engellediğinde gelişen yaygın bir tıbbi acil durumdur. Bu, arterin perfüze olduğu bölgede bölgesel miyokardiyal iskemiye neden olur.
Bu çalışma, hayatta kalma ve sağkalım deneyleri için bir tavşan modelinde in situ akut bölgesel miyokardiyal iskemi oluşturmak için basit ve güvenilir bir metodoloji kullanan bir protokolü tanımlamaktadır. Bu yöntemin ilk amacı, mitokondriyal transplantasyonun miyokardiyal nekrozun modüle edilmesi ve iskemik bir olaydan sonra postiskemik kalp fonksiyonunun arttırılması üzerindeki etkilerini değerlendirmekti. Önceki araştırmalar, mitokondriyal değişikliklerin meydana geldiğini ve iskeminin başlamasını takiben yüksek enerjili fosfat seviyelerinde hızlı bir düşüş ve oksijen kaynağında bir azalma olduğunu ve bunun da kardiyak enerji depolarında ciddi bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir4. Araştırmacılar, farmakolojik müdahaleler ve / veya prosedürel teknikler kullanarak post-iskemik fonksiyonu iyileştirmeye ve miyokardiyal doku nekrozunu azaltmaya çalışmışlardır, ancak bu teknikler sınırlı kardiyoproteksiyon sağlar ve mitokondriyal hasar ve işlev bozukluğu üzerinde minimum etkiye sahiptir 5,6,7. Ekibimiz ve diğerleri daha önce mitokondriyal hasarın öncelikle iskemi sırasında meydana geldiğini ve reperfüzyon sırasında mitokondriyal solunum fonksiyonunun korunmasıyla kasılma iyileşmesinin artabileceğini ve miyokard enfarktüs boyutunun azaldığını göstermiştir 8,9,10. Bu nedenle, reperfüzyondan önce iskemiden etkilenmeyen dokulardan iskemi bölgesine mitokondriyal transplantasyonun miyokardiyal nekrozu azaltmak ve miyokardiyal fonksiyonu geliştirmek için alternatif bir yaklaşım sağlayacağını varsaydık. Burada, bu teoriyi test etmek için kullanılan protokolü ve ilk çalışma analizimizden elde edilen temsili sonuçları detaylandırıyoruz.
Ayrıca, birçok araştırmacı miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının etkisini tanımlamanın ve uygun terapötik müdahalelerin oluşturulmasının ayrılmaz bir parçası olan diğer konulara odaklanmıştır. Böyle bir araştırma alanı ön koşullandırmadır. Miyokardiyal iskemik ön koşullandırma, kısa süreli iskemik stres ile aktive olan ve sonraki uzamış iskemi atakları sırasında kardiyak hücre nekrozu oranında bir azalma ile sonuçlanan kardiyoprotektif bir mekanizmadır. Bu mekanizmalar hipoksi veya koroner oklüzyon ile aktive edilebilir. Mandel ve ark. hipoksik-hiperoksik ön koşullandırmanın nitrik oksit metabolitlerinin dengesini korumaya yardımcı olduğunu, endotelin-1 hiperüretimini azalttığını ve organ korumasını desteklediğinigöstermiştir 11. Ayrıca, tek organ ön koşullandırmasının sistemik koruma sağladığı bir fenomen olan uzaktan iskemik ön koşullandırma kavramı araştırılmıştır. Ali ve ark. elektif açık abdominal aort anevrizması onarımı yapılan hastalarda, ortak iliak arterin bir uyaran olarak hizmet etmesi için aralıklı olarak çapraz klemplenmesiyle gerçekleştirilen uzaktan ön koşullandırmanın, postoperatif miyokard yaralanması, miyokard enfarktüsü ve böbrek yetmezliği insidansını azalttığını bulmuşlardır12.
Tavşan modelleri, diğer türlere sahip modellere göre potansiyel avantajlar sunar ve diğerlerinin yanı sıra aritmilerin indüksiyonu, küresel ve bölgesel iskemik modeller ve kardiyak kasılma araştırmaları dahil olmak üzere onlarca yıldır birçok farklı senaryoda kullanılmıştır13,14,15. Tavşan kalbi bir köpek veya domuzunkinden daha küçük olmasına rağmen, cerrahi işlemleri çok daha düşük bir maliyetle kolayca gerçekleştirebilecek kadar büyüktür13. Tavşan kalbi, insan kalbine çok yakın olduğu için sıklıkla kullanılır; Gerçekten de, benzer bir metabolik hıza sahiptir, β-miyozin ağır zincirini eksprese eder ve önemli miyokardiyal ksantin oksidaz16’dan yoksundur. Burada bölgesel miyokard iskemisini indüklemek için tarif edilen teknik basit, tekrarlanabilir ve uygun maliyetlidir. Bu yöntem, global iskemi yerine sadece bölgesel iskemi indüklendiği ve ihtiyaç duyulan materyaller özelleşmediği için hem sağkalım hem de sağkalım vakalarına izin verir. İki farklı cerrahi yaklaşım (yani sternotomi ve mini-torakotomi) kullanılabilir, böylece operatör ve deneysel protokoller çalışma tasarımı açısından daha fazla özgürlük sağlar. Ek olarak, prosedür kardiyopulmoner baypas kullanımını gerektirmez. Bu bağlamda, koroner arter baypas greftlemeye minimal invaziv yaklaşımlar, çok damar revaskülarizasyonuna ihtiyaç duyan hastalar için değerli alternatifler haline gelmiştir17,18. Bu model, bu yaklaşımlar arasındaki farkları incelemek ve cerrahi kursiyerler için hayvan temelli bir öğrenme aracı sağlamak için kullanılabilir. Ek olarak, bu model kullanılarak kalp kateterizasyonu yapılması fizyolojik araştırma ve/veya cerrahi eğitim için yararlı olabilir.
Modelimiz, bölgesel miyokardiyal iskemiyi indüklemenin ve ardından enfarktüs boyutunun, miyokardiyal fonksiyonun ve hücresel değişikliklerin ölçülmesinin önemli olduğu uygulamalar için bir metodoloji sunmaktadır. Bu protokolle, organellerin içselleştirilmesini, oksijen tüketimini, yüksek enerjili fosfat sentezini ve sitokin aracılarının ve proteomik yolakların indüksiyonunu inceleyerek hücresel fonksiyon ve iskemiye adaptasyon ve önerilen terapötik müdahalenin (yani mitokondriyal transplantasyon) çeşitli belirteçlerini değerlendirebildik. Bu sonuçlar miyokardiyal enerjinin, hücre canlılığının ve kardiyak fonksiyonun korunmasında önemlidir ve iskemi-reperfüzyon hasarını takiben kardiyoprotektif tekniklerin objektif olarak değerlendirilmesine olanak tanır. Bu model, post-iskemik miyokardiyal patoloji ve iyileşme alanında benzer biyolojik yolları ve alternatifleri incelemek için kullanılabilir.
Bu protokolün amacı, hayatta kalma ve sağkalım deneyleri için tavşanda in situ akut bölgesel miyokard iskemiyi indüklemek için yüksek oranda tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Bu model, yüksek sağkalım, düşük intraoperatif mortalite ve minimum morbidite ile bir metodoloji sağlar19. Akut bölgesel miyokard iskemisi için diğer modeller, radyoaktif işaretli malzemeler, kontrast maddeler, manyetik rezonans görüntüleme veya bilgisayar simülasyonları kullanılarak tanımlanmıştır20,21,22. Protokolümüz, uygun maliyetli, sürekli olarak tekrarlanabilir ve düşük teknik talebe sahip güvenilir ve basit bir metodoloji sağlar ve bu nedenle cerrahi uzmanlığı olmayan araştırmacılar tarafından gerçekleştirilebilir. Bu protokol, sol mini torakotomi kullanan bir sağkalım projesini veya orta hat sternotomi kullanan bir sağkalım olmayan modeli barındırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolümüz, tavşanda akut bölgesel miyokardiyal iskemi yapmak için güvenilir bir metodoloji göstermektedir. Sol mini torakotomi yaklaşımı, insizyon ve ilişkili ağrının en aza indirilmesi gereken sağkalım vakaları için idealdir. Daha da önemlisi, ekstübasyondan önce diüretik tedavisi gerekli değildi ve sağkalım olmayan grupta intraoperatif olarak veya sağkalım grubunda postoperatif 4 haftada mortalite yoktu. Protokolün tasarımı sağkalım dışı bir vaka gerektirdiğinde veya global ve bö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolün kullanıldığı orijinal çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibeleri HL-103642 ve HL-088206 tarafından desteklenmiştir
Materials
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
Riferimenti
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discovery Today: Disease Models. 5 (3), 185-193 (2008).
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D. Modeling cardiac ischemia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1080, 395-414 (2006).
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
