Model af iskæmi og reperfusionsskade hos kaniner

Summary

Denne undersøgelse viser en meget reproducerbar dyremodel for akut regional myokardieiskæmi og reperfusionsskade hos kaniner ved hjælp af en venstre mini-thoracotomi til overlevelsestilfælde eller en midterlinjesternotomi til ikke-overlevelsestilfælde.

Abstract

Protokollen her giver en enkel, meget replikerbar metode til at inducere in situ akut regional myokardieiskæmi hos kaninen til ikke-overlevelses- og overlevelseseksperimenter. New Zealand White voksen kanin er bedøvet med atropin, acepromazin, butorphanol og isofluran. Dyret intuberes og anbringes på mekanisk ventilation. Et intravenøst kateter indsættes i den marginale ørevene til infusion af medicin. Dyret er præmedicineret med heparin, lidokain og lakteret Ringers opløsning. En carotis cut-down udføres for at opnå arteriel linjeadgang til blodtryksovervågning. Udvalgte fysiologiske og mekaniske parametre overvåges og registreres ved kontinuerlig realtidsanalyse.

Med dyret bedøvet og fuldt bedøvet udføres enten et fjerde interkostalt rum lille venstre thoracotomi (overlevelse) eller midterlinie sternotomi (ikke-overlevelse). Perikardiet åbnes, og den venstre forreste nedadgående (LAD) arterie er placeret.

En polypropylensutur føres rundt om den anden eller tredje diagonale gren af LAD-arterien, og polypropylenfilamentet trækkes gennem et lille vinylrør, der danner en snare. Dyret udsættes for 30 minutters regional iskæmi, opnået ved at lukke LAD ved at stramme snaren. Myokardieiskæmi bekræftes visuelt af epikardiets regionale cyanose. Efter regional iskæmi løsnes ligaturen, og hjertet får lov til at perfusere igen.

For både overlevelses- og ikke-overlevelsesforsøg kan myokardiefunktionen vurderes via en ekkokardiografi (ECHO) måling af den fraktionelle forkortelse. For ikke-overlevelsesundersøgelser kan data fra sonomikrometri indsamlet ved hjælp af tre digitale piezoelektriske ultralydssonder implanteret i det iskæmiske område og venstre ventrikel udviklet tryk (LVDP) ved hjælp af et apikalt indsat venstre ventrikel (LV) kateter kontinuerligt erhverves til evaluering af henholdsvis den regionale og globale myokardiefunktion.

Til overlevelsesundersøgelser lukkes snittet, en thoracentese med venstre nål udføres til pleural luftevakuering, og postoperativ smertekontrol opnås.

Introduction

Hjerte-kar-sygdomme er den største dødsårsag i verden og bidrager til over 18 millioner dødsfald hvert år ^1,2,3. Akut myokardieinfarkt (MI) er en almindelig medicinsk nødsituation, der udvikler sig, når en blodprop eller et stykke atheromatøs plak blokerer blodgennemstrømningen i en koronararterie. Dette forårsager regional myokardieiskæmi i det område, som arterien perfuserer.

Denne undersøgelse beskriver en protokol, der anvender en enkel og pålidelig metode til at skabe in situ akut regional myokardieiskæmi i en kaninmodel til ikke-overlevelses- og overlevelsesforsøg. Det oprindelige mål med denne metode var at evaluere virkningerne af mitokondrietransplantation på modulerende myokardienekrose og øge den post-iskæmiske hjertefunktion efter en iskæmisk begivenhed. Tidligere forskning har vist forekomsten af mitokondrieændringer og et hurtigt fald i fosfatniveauer med høj energi efter iskæmi og en reduktion i iltforsyningen, hvilket resulterer i et drastisk fald i hjerteenergilagrene⁴. Forskere har forsøgt at forbedre post-iskæmisk funktion og mindske myokardievævsnekrose ved hjælp af farmakologiske indgreb og / eller procedureteknikker, men disse teknikker giver begrænset kardiobeskyttelse og har minimal indvirkning på mitokondrieskader og dysfunktion ^5,6,7. Vores team og andre har tidligere vist, at mitokondrieskader primært opstår under iskæmi, og at kontraktil genopretning kan forbedres, og myokardieinfarktstørrelsen faldt med bevarelsen af mitokondriel åndedrætsfunktion under reperfusion ^8,9,10. Således antog vi, at mitokondrietransplantation fra væv, der ikke er påvirket af iskæmi til området med iskæmi før reperfusion, ville give en alternativ tilgang til at reducere myokardienekrose og forbedre myokardiefunktionen. Heri beskriver vi protokollen, der bruges til at teste denne teori og de repræsentative resultater opnået fra vores indledende undersøgelsesanalyse.

Desuden har flere forskere fokuseret på andre emner, der er integreret i at definere virkningen af myokardieiskæmi-reperfusionsskade og etablere passende terapeutiske interventioner. Et sådant forskningsområde er prækonditionering. Myokardial iskæmisk prækonditionering er en kardiobeskyttende mekanisme aktiveret af kort iskæmisk stress, der resulterer i en reduktion i hastigheden af hjertecellenekrose under efterfølgende episoder af langvarig iskæmi. Disse mekanismer kan aktiveres ved enten hypoxi eller koronar okklusion. Mandel et al. demonstrerede, at hypoxisk-hyperoxisk prækonditionering hjalp med at opretholde balancen mellem nitrogenoxidmetabolitter, reducerede endothelin-1 hyperproduktion og understøttede organbeskyttelse¹¹. Desuden er begrebet fjerniskæmisk prækonditionering, et fænomen, hvor enkeltorganprækonditionering giver systemisk beskyttelse, blevet undersøgt. Ali et al. fandt, at hos patienter, der gennemgik elektiv åben abdominal aortaaneurismereparation, fjernkonditionering, udført ved intermitterende krydsklemme af den fælles iliacarterie for at tjene som stimulus, reducerede forekomsten af postoperativ myokardieskade, myokardieinfarkt og nedsat nyrefunktion¹².

Kaninmodeller tilbyder potentielle fordele i forhold til modeller med andre arter og er blevet brugt i flere forskellige scenarier i årtier, herunder induktion af arytmier, globale og regionale iskæmiske modeller og hjertekontraktionsforskning, blandt andet^13,14,15. Selvom kaninhjertet er mindre end en hund eller gris, er det stort nok til nemt at udføre kirurgiske procedurer til en meget lavere pris¹³. Kaninhjertet bruges ofte, da det er tæt parallelt med det menneskelige hjerte; Faktisk har den en lignende metabolisk hastighed, udtrykker β-myosin tung kæde og mangler signifikant myokardial xanthinoxidase¹⁶. Teknikken heri beskrevet til at fremkalde regional myokardieiskæmi er enkel, gentagelig og omkostningseffektiv. Denne metode giver mulighed for både ikke-overlevelses- og overlevelsestilfælde, da kun regional iskæmi induceres snarere end global iskæmi, og de nødvendige materialer er ikke-specialiserede. To forskellige kirurgiske tilgange (dvs. sternotomi og mini-thoracotomi) kan anvendes, hvilket giver operatøren og eksperimentelle protokoller mere frihed med hensyn til undersøgelsesdesignet. Derudover kræver proceduren ikke brug af en kardiopulmonal bypass. I denne sammenhæng er minimalt invasive tilgange til koronararterie bypass podning blevet værdifulde alternativer for patienter med behov for multi-kar revaskularizaiton,^17,18. Denne model kan bruges til at studere forskellene mellem disse tilgange og give et dyrebaseret læringsværktøj til kirurgiske praktikanter. Derudover kan udførelse af hjertekateterisering ved hjælp af denne model være nyttig til fysiologisk forskning og / eller kirurgisk træning.

Vores model giver en metode til applikationer, hvor inducering af regional myokardieiskæmi og efterfølgende måling af infarktstørrelse, myokardiefunktion og cellulære ændringer er af betydning. Med denne protokol har vi været i stand til at evaluere flere markører for cellulær funktion og tilpasning til iskæmi og det foreslåede terapeutiske indgreb (dvs. mitokondrietransplantation) ved at undersøge internaliseringen af organeller, iltforbrug, fosfatsyntese med høj energi og induktion af cytokinmediatorer og proteomiske veje. Disse resultater er vigtige for at bevare myokardieenergi, cellelevedygtighed og hjertefunktion og giver mulighed for objektiv evaluering af kardioprotektive teknikker efter iskæmi-reperfusionsskade. Denne model kan bruges til at studere lignende biologiske veje og alternativer inden for post-iskæmisk myokardiepatologi og genopretning.

Målet med denne protokol er at tilvejebringe en meget reproducerbar metode til at inducere in situ akut regional myokardieiskæmi hos kaninen til ikke-overlevelses- og overlevelsesforsøg. Denne model giver en metode med høj overlevelse, lav intraoperativ dødelighed og minimal sygelighed¹⁹. Andre modeller for akut regional myokardieiskæmi er blevet beskrevet ved hjælp af radioaktivt mærkede materialer, kontrastmidler, magnetisk resonansbilleddannelse eller computersimuleringer^20,21,22. Vores protokol giver en pålidelig og enkel metode, der er omkostningseffektiv, konsekvent reproducerbar og har en lav teknisk efterspørgsel og dermed kan udføres af efterforskere uden kirurgisk ekspertise. Denne protokol rummer enten et overlevelsesprojekt ved hjælp af en venstre mini-thoracotomi eller en ikke-overlevelsesmodel ved hjælp af en midterlinjesternotomi.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i henhold til National Institutes of Health’s retningslinjer for dyrepleje og brug og blev godkendt af Boston Children’s Hospitals Animal Care and Use Committee (protokol 20-08-4247R). Alle dyrene modtog human pleje i overensstemmelse med vejledningen om pleje og brug af forsøgsdyr. 1. Dyrearter, bedøvelsesmidler og smertestillende midler Dyrearter: Brug New Zealand hvide kaniner (vildtype stamme; kvindelig køn; seksuelt moden 15-2…

Representative Results

Efter protokollen (figur 1) blev myokardieiskæmi bekræftet straks ved den direkte visualisering af cyanose af epikardiet. Standard EKG’er (tre lemmer: I, II og III og tre beregnede forstærkede ledninger: aVL, aVR og aVF) blev registreret kontinuerligt præiskæmi, under iskæmi og ved reperfusion (figur 2). EKG’erne demonstrerer takykardi, arytmier (dvs. ventrikelflimmer), ledningssystemdefekter (dvs. bundtgrenblok), udvikling af i…

Discussion

Vores protokol demonstrerer en pålidelig metode til udførelse af akut regional myokardieiskæmi hos kaninen. Den venstre mini-thoracotomi-tilgang er ideel til overlevelsestilfælde, hvor snittet og tilhørende smerte skal minimeres. Det er vigtigt, at diuretisk behandling ikke var nødvendig før ekstubation, og der var ingen dødelighed intraoperativt i ikke-overlevelsesgruppen eller efter 4 uger postoperativt i overlevelsesgruppen. Når udformningen af protokollen kræver et ikke-overlevelsestilfælde, eller når der…

Materials

#10 blade	Bard Parker	371210
#11 blade	Fisher Scientific	B3L
22 G PIV needle	BD Insyte	381423
Acepromazine	VETONE	NDC 13985-587-50	0.5 mg/kg IM and IV
Aline pressure bag	Infu-Stat	2139
Angiocath	Becton Dickinson	382512
Arterial Catheter	Teleflex	MC-004912
Atropine	Hikma Pharmaceuticals	NDC 0641-6006-01	0.01 mg/kg IM
Betadine and 70% isopropyl alcohol	McKesson	NDC 68599-2302-6
Blood gas machine	Siemens	MRK0025
Bovie	Valleylab	E6008
Bulldog clamps	World Precision Instruments	14119
Bupivacaine	Auromedics	NDC 55150-249-50	3 mg/kg IM
Butorphanol	Roxane	NDC 2054-3090-36	0.5 mg/kg IM
Clear acetate sheet	Oxford Instruments	ID 51-1625-0213
Clipers	Andis	AGC2
DeBakey forceps	Integra	P6280
Echocardiography machine	Philips	IE33 F1
Electrocardiography machine	Meditech	MD908B
Endotracheal tube	Medline	#922774
Fentanyl	West-Ward	NDC 0641-6030-01	1–4 µg/kg transdermal patch
Formaldehyde solution 10%	Epredia	94001
Glass plates	United Scientific	B01MUHX6MR
Heparin Sodium	Sagent	NDC 69-0058-02	1000U in 1 mL 3 mg/kg
Hot water blanket	3M	55577
Isoflurane	Penn Veterinary Supply, INC	NDC 50989-606-15	1%–3%
Ketamine	Dechra	NDC 42023-138-10	10 mg/kg IV
Lab Chart 7 Acquisition Software	Adinstruments
Lactated Ringer's solution	ICUmedical	NDC 0990-7953-09	10 mL/kg/h
Laryngoscope	Welch Allyn	68044
Left ventricule lumen catheter 3Fr	McKesson	385764-EA
Lidocaine (1%)	Pfizer	4276-01	1–1.5 mL/kg IV
LVDP transducer	Edward	PDP-ED
Marking pen	Viscot	1451SR-100 Unsterile
Mayo scissors	Mayo	S7-1098
Medetomidine	Entireoly Pets Pharmacy	NDC 015914-005-01	0.25 mg/kg IM
Metzenbaum scissors	Cole-Parmer	UX-10821-05
Monastra. Blue pigment 98%	Chemsavers	MBTR1100G
Monocryl 5-0	Ethicon	Y463G
Mosquito clamp	Shioda	802N
PDS 3-0	Ethicon	42312201
Piezoelectric sonomicrometry crystals	Sonometrics	Small 2mm round
Plegets	DeRoyal	32-363
Povuine Iodine Prep Solutions	Medline	MDS093940
Precision vaporized system face mask	Yuwell	B07PNH69BF
Prolene 3-0	Ethicon	8665G
Proline 5-0	Ethicon	8661G
Pulse oximetry probe	Masimo	9216-U
Rib spreader	Medline	MDS5621025
S12 Pediatric Sector Probe	Phillips	21380A
Sonomicrometer	Sonometrics	BZ10123724
Sterile gauze	Medline	3.00802E+13
Sterile towels	McKesson	MON 277860EA
Sternal retractor	Medline	MDS5610321
Sutures for closure	J&J Dental	8698G
Telemetriy monitor	Meditech	MD908B
Temperature probe	Omega	KHSS-116G-RSC-12
Triphenyl tetrazolium chloride (1%)	Millipore	MFCD00011963
Ventilator	MedGroup	MSLGA 11
Vicryl 2-0	Ethicon	V635H
Vinyl tubing	ABE	DISW 3001