الكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي
Summary
هنا ، نصف طريقة للكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المرتدة (ROS) في أنسجة الأرز في الاستجابة المناعية المرتبطة بالنمط الجزيئي المرتبط بمسببات الأمراض. هذه الطريقة بسيطة وموحدة وتولد نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة.
Abstract
تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا حيوية في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك استشعار الضغوط اللاأحيائية والحيوية. عند الإصابة بمسببات الأمراض أو التحدي مع المواد الكيميائية المرتبطة بمسببات الأمراض (الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض [PAMPs]) ، يتم تحفيز مجموعة من الاستجابات المناعية ، بما في ذلك انفجار أنواع الأكسجين التفاعلية ، بسرعة في النباتات ، والتي تسمى المناعة التي يسببها PAMP (PTI). انفجار ROS هو استجابة PTI المميزة ، والتي يتم تحفيزها بواسطة مجموعة من أوكسيديز NADPH المترجمة بغشاء البلازما – بروتينات عائلة RBOH. تتكون الغالبية العظمى من أنواع الأكسجين التفاعلية من بيروكسيد الهيدروجين (H2 O2) ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة وثبات بواسطة طريقة التلألؤ الكيميائي القائمة على اللومينول. التلألؤ الكيميائي هو تفاعل منتج للفوتون يخضع فيه اللومينول ، أو مشتقه (مثل L-012) ، لتفاعل الأكسدة والاختزال مع أنواع الأكسجين التفاعلية تحت تأثير محفز. تصف هذه الورقة طريقة التلألؤ الكيميائي المحسنة القائمة على L-012 للكشف عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية apoplast في الوقت الفعلي عند استنباط PAMP في أنسجة الأرز. الطريقة سهلة وثابتة وموحدة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في ظل ظروف خاضعة لرقابة صارمة.
Introduction
تتكون أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من سلسلة من مشتقات الأكسجين النشطة كيميائيا ، بما في ذلك جذور أنيون الأكسيد الفائق (O2-) ومشتقاته ، وجذور الهيدروكسيل (OH-) ، وبيروكسيد الهيدروجين ، ومنتجات تفاعلات الأكسجين المفردة أو تفاعلات تقليل الأكسدة ، والتي يتم إنتاجها باستمرار في البلاستيدات والبلاستيدات الخضراء ، والميتوكوندريا ، والبيروكسيسومات ، وغيرها من المواقع تحت الخلوية1 . تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية أدوارا مهمة في العديد من العمليات البيولوجية وهي ضرورية لجميع النباتات2،3،4. يختلف الطيف الواسع لوظائف ROS من تنظيم النمو والتنمية إلى إدراك الضغوط اللاأحيائيةوالحيوية 5،6،7،8.
في الجهاز المناعي للنبات ، تدرك المستقبلات الموضعية لغشاء بلازما الخلية النباتية – ما يسمى مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) – الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض الكيميائية المشتقة من مسببات الأمراض (PAMPs). يؤدي هذا التعرف إلى سلسلة من الاستجابات المناعية السريعة ، بما في ذلك تدفق الكالسيوم ، وانفجار ROS ، وشلال MAPK. وبالتالي ، فإن هذه الطبقة من المناعة تسمى المناعة التي يسببها PAMP (PTI). انفجار ROS هو استجابة PTI المميزة ، والتي يتم تطبيق تحديدها على نطاق واسع على الدراسات المتعلقة ب PTI 9,10. يعزى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الناجم عن PAMPs إلى أوكسيديز NADPH المقيم في غشاء البلازما ، أو بروتينات عائلة متجانسة أوكسيديز الانفجار التنفسي (RBOH) ، والتي تنقل الإلكترونات من NADPH الخلوي أو NADH إلى الأكسجين خارج الخلية لإنتاج أكسيد فائق (O 2–) يتم تحويله تلقائيا إلى بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) بواسطةديسموتاز فائقالأكسيد 8 . انفجار ROS الناجم عن PAMP سريع جدا ، ويظهر بعد دقائق قليلة فقط من علاج PAMP ويبلغ ذروته في ~ 10-12 دقيقة. تتكون الغالبية العظمى من جزيئات أنواع الأكسجين التفاعلية من بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O2) ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة وثبات باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي.
في التلألؤ الكيميائي ، يتفاعل كاشف التلألؤ الكيميائي مع الأكسجين النشط ، تحت تأثير عامل حفاز ، لإنتاج وسيطة الحالة المثارة. بعد ذلك، تعود الإلكترونات الموجودة في الناتج إلى الحالة الأرضية من خلال الانتقال غير الإشعاعي، وتنبعث منها فوتونات. تشمل كواشف التلألؤ الكيميائي الشائعة اللومينول و L-012 ، مع سيطرة اللومينول على التطبيق11،12،13. ومع ذلك ، يختار المزيد من الباحثين L-012 للكشف عن إنتاج ROS ، نظرا لأن L-012 يتمتع بكفاءة انبعاث ضوء أعلى بكثير في ظل ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة أو شبه المحايدة مقارنة باللومينول.
تصف هذه الورقة طريقة التلألؤ الكيميائي المحسنة ، استنادا إلى L-012 ، للكشف في الوقت الفعلي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بعد استنباط PAMPs في أقراص أوراق أنسجة الأرز (Oryza sativa) والغمد. الطريقة المقدمة هنا بسيطة ومستقرة وموحدة ، وقابلة للتكيف بدرجة كبيرة لتلبية الاحتياجات التجريبية المختلفة. البيانات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير في ظل ظروف خاضعة لرقابة صارمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الغرض من هذه الدراسة هو إنشاء طريقة عالية الكفاءة لتحديد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المبكر استجابة ل PAMP في أنسجة الأرز. توفر هذه الطريقة إجراء موحدا لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية في الوقت الفعلي الناتجة عن أنسجة الأرز المعالجة. هذه الطريقة بسيطة في التشغيل ، منخفضة التكلفة ، وا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة شنغهاي للعلوم الطبيعية (رقم المنحة: 21ZR1429300 / BS1500016) ، جامعة شنغهاي جياو تونغ (برنامج Agri-X ، رقم المنحة: AF1500088/002) ، مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للبذور الزراعية (رقم المنحة: ZXWH2150201/001) إلى Jiangbo Fan ، ومن خلال مشروع التعاون الطبي الهندسي لجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة: 21X010301734) إلى Can Li.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Riferimenti
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
