במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי אפופלסטי (ROS) ברקמות אורז בתגובה חיסונית מולקולרית המופעלת על ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן. שיטה זו פשוטה, סטנדרטית ומייצרת תוצאות הניתנות לשחזור בתנאים מבוקרים.
מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקידים חיוניים במגוון תהליכים ביולוגיים, כולל חישה של עקה אביוטית וביוטית. עם זיהום פתוגן או אתגר עם כימיקלים הקשורים לפתוגן (דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים [PAMPs]), מערך של תגובות חיסוניות, כולל התפרצות ROS, מושרות במהירות בצמחים, אשר נקרא PAMP-triggered immunity (PTI). התפרצות ROS היא תגובת PTI בולטת, אשר מזרזת על ידי קבוצה של NADPH oxidases מקומי של קרום פלזמה – חלבונים ממשפחת RBOH. הרוב המכריע של ROS מורכב מי חמצן (H 2 O2), אשר ניתןלזהות בקלות ובהתמדה על ידי שיטת chemiluminescence מבוסס luminol. כימילומינסנציה היא תגובה המייצרת פוטונים שבה לומינול, או הנגזרת שלו (כגון L-012), עובר תגובת חמצון-חיזור עם ROS תחת פעולה של זרז. מאמר זה מתאר שיטה כימילומינסנציה אופטימלית מבוססת L-012 לזיהוי ייצור אפופלסט ROS בזמן אמת עם אליציטוט PAMP ברקמות אורז. השיטה קלה, יציבה, סטנדרטית וניתנת לשחזור בתנאים מבוקרים היטב.
מיני חמצן תגובתי (ROS) כוללים סדרה של נגזרות חמצן פעילות מבחינה כימית, כולל רדיקלים של אניון סופראוקסיד (O2-) ונגזרותיו, רדיקלים הידרוקסילים (OH–), מי חמצן, ותוצרים של חמצן סינגלט או תגובות חיזור חמצון, המיוצרים באופן קבוע בפלסטידים ובכלורופלסטים, מיטוכונדריה, פרוקסיזומים ומקומות תת-תאיים אחרים1 . ROS ממלא תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים והם חיוניים לכל הצמחים 2,3,4. הספקטרום הרחב של תפקודי ROS משתנה מוויסות גדילה והתפתחות ועד לתפיסה של עקה אביוטית וביוטית 5,6,7,8.
במערכת החיסון של הצמח, קולטנים מקומיים של קרום הפלזמה של תאי הצמח – מה שמכונה קולטני זיהוי תבניות (PRR) – תופסים כימיקלים שמקורם בפתוגן – תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs). זיהוי זה מעורר סדרה של תגובות חיסוניות מהירות, כולל זרם סידן, התפרצות ROS ומפל MAPK; לכן, שכבת חסינות זו נקראת PAMP-triggered immunity (PTI). התפרצות ROS היא תגובת PTI בולטת, שקביעתה מיושמת באופן נרחב במחקרים הקשורים ל- PTI 9,10. ייצור ROS המופעל על ידי PAMPs מיוחס לחלבונים ממשפחת NADPH oxidase (הומולוג של קרום הפלזמה), או RBOH (Respiratory burst oxidase homolog), אשר מעבירים אלקטרונים מ-NADPH ציטוסולי או NADH לחמצן חוץ-תאי כדי לייצר סופראוקסיד (O 2–) אשר מומר באופן ספונטני למי חמצן (H 2 O 2) על ידי סופראוקסיד דיסמוטאז8 . פרץ ROS המופעל על ידי PAMP הוא מהיר למדי, מופיע רק כמה דקות לאחר טיפול PAMP ומגיע לשיא של ~ 10-12 דקות. הרוב המכריע של מולקולות ROS מכילות מי חמצן (H 2 O2), אשר ניתן לזהות בקלות ובהתמדה באמצעות בדיקת כימילומינסנציה.
בכימילומינסנציה, מגיב הכימילומינסנציה מגיב עם חמצן פעיל, תחת פעולה של זרז, כדי לייצר את מתווכי המצב הנרגש. לאחר מכן, האלקטרונים במכפלה חוזרים למצב הקרקע באמצעות מעבר לא קרינתי ופולטים פוטונים. ריאגנטים כימילומינסנטיים נפוצים כוללים luminol ו- L-012, כאשר luminol שולט ביישום11,12,13. עם זאת, חוקרים נוספים בוחרים ב- L-012 כדי לזהות ייצור ROS, מכיוון של- L-012 יש יעילות פליטת אור גבוהה בהרבה בתנאי pH ניטרליים או כמעט ניטרליים בהשוואה ללומינול.
מאמר זה מתאר שיטת כימילומינסנציה אופטימלית, המבוססת על L-012, לזיהוי בזמן אמת של ייצור ROS לאחר חיסול PAMPs בדיסקים ובמעטפת של רקמות-עלי אורז (Oryza sativa). השיטה המסופקת כאן היא פשוטה, יציבה וסטנדרטית, והיא ניתנת להתאמה גבוהה כדי לענות על צרכים ניסיוניים שונים. הנתונים המתקבלים בשיטה זו ניתנים לשחזור גבוה בתנאים מבוקרים היטב.
מטרת מחקר זה הייתה לבסס שיטה יעילה ביותר לכימות ייצור מוקדם של ROS בתגובה ל-PAMP ברקמות אורז. שיטה זו מספקת הליך סטנדרטי לקביעה בזמן אמת של אפופלסט ROS המיוצר מרקמות אורז מטופלות. שיטה זו פשוטה בתפעול, נמוכה בעלות, ברורה בהרכב, ובלתי תלויה בערכות מסחריות. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לחקור את ה?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן שנחאי למדעי הטבע (מספר מענק: 21ZR1429300/BS1500016), אוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג (תוכנית Agri-X, מספר מענק: AF1500088/002), מרכז החדשנות השיתופית של שנחאי של זרעים חקלאיים (מספר מענק: ZXWH2150201/001) לג’יאנגבו פאן, ועל ידי פרויקט שיתוף הפעולה הרפואי-הנדסי של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (מספר מענק: 21X010301734) לקאן לי.
96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
Gen5 | BioTek | software | |
L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
MS Medium | Solarbio | M8521 | |
NaCLO | Aladdin | S101636 | |
Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
Phytagel | Sigma | P8169 | |
Sampler | Miltex | 15110-40 | |
Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
Tris | Sangon Biotech | A610195 |