स्थापित मुराइन कोलोनोइड्स पर विट्रो में आंतों की सूजन के उपकला प्रभावों का अध्ययन
Summary
हम 3-आयामी कोलोनोइड्स के विकास के लिए मुराइन कोलोनिक क्रिप्ट ्स के अलगाव का विवरण देने वाले एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। स्थापित कोलोनोइड्स को तब एक भड़काऊ चुनौती प्राप्त करने या उपकला मोनोलेयर स्थापित करने के लिए निर्देशित होने से पहले मेजबान उपकला की सेलुलर संरचना को प्रतिबिंबित करने के लिए टर्मिनल रूप से विभेदित किया जा सकता है।
Abstract
आंतों के उपकला मानव स्वास्थ्य में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, मेजबान और बाहरी वातावरण के बीच एक बाधा प्रदान करता है। यह अत्यधिक गतिशील कोशिका परत माइक्रोबियल और प्रतिरक्षा आबादी के बीच रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करती है और आंतों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने में मदद करती है। उपकला बाधा का विघटन सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) की एक पहचान है और चिकित्सीय लक्ष्यीकरण के लिए रुचि है। 3-आयामी कोलोनॉइड कल्चर सिस्टम आईबीडी रोगजनन में आंतों के स्टेम सेल गतिशीलता और उपकला सेल फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी इन विट्रो मॉडल है। आदर्श रूप से, जानवरों के सूजन उपकला ऊतक से कोलोनोइड स्थापित करना बीमारी पर आनुवंशिक और आणविक प्रभावों का आकलन करने में सबसे फायदेमंद होगा। हालांकि, हमने दिखाया है कि विवो उपकला में परिवर्तन आवश्यक रूप से तीव्र सूजन वाले चूहों से स्थापित कोलोनोइड्स में बरकरार नहीं हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने भड़काऊ मध्यस्थों के कॉकटेल के साथ कोलोनोइड्स का इलाज करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो आमतौर पर आईबीडी के दौरान ऊंचा होता है। जबकि इस प्रणाली को विभिन्न संस्कृति स्थितियों के लिए सर्वव्यापी रूप से लागू किया जा सकता है, यह प्रोटोकॉल स्थापित कोलोनोइड्स से प्राप्त विभेदित कोलोनोइड्स और 2-आयामी मोनोलेयर दोनों पर उपचार पर जोर देता है। एक पारंपरिक संस्कृति सेटिंग में, कोलोनोइड्स आंतों की स्टेम कोशिकाओं से समृद्ध होते हैं, जो स्टेम सेल आला का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान करते हैं। हालांकि, यह प्रणाली आंतों के शरीर विज्ञान की विशेषताओं के विश्लेषण की अनुमति नहीं देती है, जैसे कि बाधा समारोह। इसके अलावा, पारंपरिक कोलोनोइड प्रोइन्फ्लेमेटरी उत्तेजनाओं के लिए टर्मिनल रूप से विभेदित उपकला कोशिकाओं की सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर प्रदान नहीं करते हैं। यहां प्रस्तुत विधियां इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए एक वैकल्पिक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करती हैं। 2-आयामी मोनोलेयर कल्चर सिस्टम भी विवो में चिकित्सीय दवा स्क्रीनिंग के लिए एक अवसर प्रदान करता है। कोशिकाओं की इस ध्रुवीकृत परत को सेल के बेसल साइड पर भड़काऊ मध्यस्थों के साथ इलाज किया जा सकता है और आईबीडी उपचार में उनकी उपयोगिता निर्धारित करने के लिए कथित चिकित्सीय के साथ सहवर्ती रूप से इलाज किया जा सकता है।
Introduction
सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) एक पुरानी, उत्सर्जक और रिलैप्सिंग बीमारी है जो सूजन और नैदानिक उत्तेजना के एपिसोड की विशेषता है। आईबीडी का एटियलजि बहुक्रियाशील है, लेकिन रोग की प्रमुख विशेषताओं में दोषपूर्ण बाधा कार्य और आंतों के उपकला की बढ़ी हुई पारगम्यता शामिल है, इसके अलावा उपकला डिब्बे 1,2 के भीतर सक्रिय प्रोइन्फ्लेमेटरी सिग्नलिंग कैस्केड शामिल हैं। आईबीडी के दौरान उपकला प्रतिक्रिया को पुन: उत्पन्न करने के लिए कई इन विट्रो और इन विवो मॉडल का उपयोग किया गया है, जिसमें सेल कल्चर और सूजनके मुराइन मॉडल शामिल हैं। हालांकि, इन सभी प्रणालियों में महत्वपूर्ण कमियां हैं जो आईबीडी4 के दौरान उपकला परिवर्तनों को पुन: उत्पन्न करने की उनकी क्षमता को सीमित करती हैं। आईबीडी का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली अधिकांश सेल लाइनें रूपांतरित होती हैं, एक मोनोलेयर बनाने की क्षमता होती है, और3 को अलग कर सकती हैं लेकिन आंतरिक रूप से मेजबान में गैर-रूपांतरित आंतों के उपकला कोशिकाओं की तुलना में अलग-अलग प्रचार करती हैं। आईबीडी का अध्ययन करने के लिए सूजन के कई अलग-अलग मुराइन मॉडल का उपयोग किया जाता है, जिनमें से कुछ में नॉकआउट मॉडल, संक्रामक मॉडल, रासायनिक भड़काऊ मॉडल और टी-सेल ट्रांसफर मॉडल 5,6,7,8 शामिल हैं। जबकि प्रत्येक आईबीडी के कुछ एटियलॉजिकल पहलुओं का अध्ययन कर सकता है, जैसे कि आनुवंशिक प्रवृत्ति, बाधा शिथिलता, प्रतिरक्षा विनियमन, और माइक्रोबायोम, वे रोग की बहुक्रियाशील प्रकृति का अध्ययन करने की उनकी क्षमता में सीमित हैं।
एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स सहित आंतों के ऑर्गेनोइड, पिछले दशक में न केवल आंतों के स्टेम कोशिकाओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी इन विट्रो मॉडल के रूप में स्थापित किए गए हैं, बल्कि आंतों के होमियोस्टैसिस और बीमारी में आंतों के उपकला की बाधा अखंडता और कार्य की भूमिका भी है। इन संस्थाओं ने आईबीडी9 के रोगजनन की हमारी समझ में महत्वपूर्ण योगदान दिया है और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए नए अवसर खोले हैं। बृहदान्त्र से कोलोनोइड्स, या स्टेम सेल-व्युत्पन्न, स्व-संगठित ऊतक संस्कृतियों को एक ऐसी प्रक्रिया में मुराइन और मानव ऊतक दोनों से विकसित किया गया है जो आंतों के क्रिप्ट के भीतर स्थित स्टेम कोशिकाओं को फैलानेऔर अनिश्चित काल तक बनाए रखने की अनुमति देता है। विवो में स्टेम सेल आला इसके विकास का समर्थन करने के लिए बाह्य कारकों पर निर्भर करता है, विशेष रूप से कैननिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग और बोन-मॉर्फोजेनिक प्रोटीन सिग्नलिंग मार्ग11। इन कारकों के अलावा कोलोनोइड्स के स्वास्थ्य और दीर्घायु को बढ़ावा देता है, लेकिन संस्कृति को स्टेम सेल जैसी स्थिति की ओर भी बढ़ाता है जो विवो उपकला सेलुलर वास्तुकला में प्रतिबिंबित नहीं होता है, जिसमें आत्म-नवीनीकरण और टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाएं12,13 दोनों होती हैं। जबकि आंतों के उपकला की कार्यक्षमता स्टेम सेल डिब्बे और विभेदित कोशिकाओं के बीच निरंतर क्रॉसटॉक पर निर्भर है, एक कोलोनॉइड संस्कृति प्रणाली में दोनों होने की क्षमता काफी सीमित है। इन सीमाओं के बावजूद, ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम एपिथेलियम एक्स विवो के आंतरिक गुणों का अध्ययन करने के लिए स्वर्ण मानक बना हुआ है। बहरहाल, हाथ में वैज्ञानिक प्रश्न का उत्तर देने के लिए वैकल्पिक संस्कृति रणनीतियों पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है।
यह दिखाया गया है कि डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) के निरंतर 7 दिन के आहार पर चूहों में उपकला सूजन और बाधा शिथिलतादोनों विकसित होते हैं। इसके अलावा, आंतों के उपकला के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस विफलता और चयापचय रीप्रोग्रामिंग, जिसे मानव आईबीडी में स्पष्ट दिखाया गया है, को भी कोलाइटिस15 के इस डीएसएस मॉडल में कैप्चर किया गया है। हालांकि, हमारे प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस विफलता की विशेषताओं को डीएसएस-उपचारित जानवरों (पूरक चित्रा 1) के क्रिप्ट से प्राप्त कोलोनोइड्स में बरकरार नहीं रखा जाता है। इस प्रकार, वैकल्पिक संस्कृति विधियों का उपयोग यह जांचते समय किया जाना चाहिए कि मुराइन आंतों की सूजन के दौरान सूजन उपकला परिवर्तनों को कैसे चलाती है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल को रेखांकित करते हैं जिसे हमने विकसित किया है जो बताता है कि 1) मुराइन कोलोनोइड्स की स्थापना के लिए पूरे कोलोनिक ऊतक से क्रिप्ट को कैसे अलग किया जाए, 2) सेल आबादी को प्रतिबिंबित करने के लिए इस सेल आबादी को टर्मिनल रूप से कैसे अलग किया जाए जैसा कि यह विवो में खड़ा है, और 3) इस इन विट्रो मॉडल में सूजन को कैसे प्रेरित किया जाए। सूजन वाले एपिथेलियम के भीतर दवा की बातचीत का अध्ययन करने के लिए, हमने म्यूरिन कोलोनोइड्स से 2-डायमेंसोनल (2 डी) मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसे भड़काऊ मध्यस्थों के साथ बेसल रूप से इलाज किया जा सकता है और दवा उपचारों के साथ एपिकल रूप से इलाज किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑर्गेनॉइड विकास ने वैज्ञानिक समुदाय के अध्ययन के तरीके में क्रांति ला दी है, जिसमें सेलुलर संरचना और एक डिश में एक जानवर या मानव से आंशिक रूप से पुन: उत्पन्न करने की क्षमता है। इसके अलावा, बीमारियों ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01DK120986 संस्थान (केपीएम को) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
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