İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi
Summary
3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.
Abstract
Bağırsak epiteli, insan sağlığında önemli bir rol oynar ve konakçı ile dış ortam arasında bir bariyer sağlar. Bu son derece dinamik hücre tabakası, mikrobiyal ve immün popülasyonlar arasındaki ilk savunma hattını sağlar ve bağırsak immün tepkisini modüle etmeye yardımcı olur. Epitel bariyerinin bozulması, inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ayırt edici özelliğidir ve terapötik hedefleme için ilgi çekicidir. 3 boyutlu kolonoid kültür sistemi, IBD patogenezinde bağırsak kök hücre dinamiği ve epitel hücre fizyolojisini incelemek için son derece yararlı bir in vitro modeldir. İdeal olarak, hayvanların iltihaplı epitel dokusundan kolonoidlerin oluşturulması, hastalık üzerindeki genetik ve moleküler etkilerin değerlendirilmesinde en faydalı olacaktır. Bununla birlikte, akut inflamasyonu olan farelerden oluşturulan kolonoidlerde in vivo epitelyal değişikliklerin mutlaka tutulmadığını gösterdik. Bu sınırlamayı ele almak için, kolonoidleri tipik olarak IBD sırasında yükselen bir inflamatuar mediatör kokteyli ile tedavi etmek için bir protokol geliştirdik. Bu sistem çeşitli kültür koşullarına her yerde uygulanabilirken, bu protokol hem farklılaşmış kolonoidler hem de yerleşik kolonoidlerden türetilen 2 boyutlu tek tabakalar üzerinde tedaviyi vurgular. Geleneksel bir kültür ortamında, kolonoidler bağırsak kök hücreleri ile zenginleştirilir ve kök hücre nişini incelemek için ideal bir ortam sağlar. Bununla birlikte, bu sistem, bariyer fonksiyonu gibi bağırsak fizyolojisinin özelliklerinin analizine izin vermez. Ayrıca, geleneksel kolonoidler, terminal olarak farklılaşmış epitel hücrelerinin proinflamatuar uyaranlara hücresel yanıtını inceleme fırsatı sunmaz. Burada sunulan yöntemler, bu sınırlamaları ele almak için alternatif bir deneysel çerçeve sağlar. 2 boyutlu tek katmanlı kültür sistemi, ex vivo terapötik ilaç taraması için de bir fırsat sunar. Bu polarize hücre tabakası, hücrenin bazal tarafında enflamatuar mediatörlerle ve IBD tedavisinde yararlılıklarını belirlemek için apikal olarak varsayılan terapötiklerle birlikte tedavi edilebilir.
Introduction
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD), inflamasyon ve klinik sessizlik atakları ile karakterize kronik, remisyonlu ve tekrarlayan bir hastalıktır. İBH’nin etiyolojisi multifaktöriyeldir, ancak hastalığın temel karakteristik özellikleri arasında epitel bölmesinde aktive olan proinflamatuar sinyal kaskadlarına ek olarak kusurlu bariyer fonksiyonu ve bağırsak epitelinin artmış geçirgenliği yer alır 1,2. IBD sırasında epitel yanıtını özetlemek için hücre kültürü ve inflamasyonun murin modelleri de dahil olmak üzere çeşitli in vitro ve in vivo modeller kullanılmıştır3. Bununla birlikte, tüm bu sistemlerin, İBH4 sırasındaki epitelyal değişiklikleri özetleme yeteneklerini sınırlayan önemli eksiklikleri vardır. IBD’yi incelemek için kullanılan hücre dizilerinin çoğu dönüştürülür, tek tabaka oluşturma yeteneğine sahiptir ve3’ü ayırt edebilir, ancak konakçıdaki dönüştürülmemiş bağırsak epitel hücrelerinden farklı şekilde özünde yayılır. IBD’yi incelemek için birkaç farklı fare inflamasyon modeli kullanılır, bunlardan bazıları nakavt modelleri, enfeksiyöz modeller, kimyasal enflamatuar modeller ve T hücresi transfer modelleri5,6,7,8’i içerir. Her biri IBD’nin genetik yatkınlıklar, bariyer disfonksiyonu, immün deregülasyon ve mikrobiyom gibi belirli etiyolojik yönlerini inceleyebilse de, hastalığın multifaktöriyel doğasını inceleme yetenekleri sınırlıdır.
Enteroidler ve kolonoidler de dahil olmak üzere bağırsak organoidleri, son on yılda, sadece bağırsak kök hücrelerinin dinamiklerini değil, aynı zamanda bağırsak epitelinin bariyer bütünlüğünü ve işlevini bağırsak homeostazı ve hastalığında oynadıkları rolü incelemek için yararlı bir in vitro model olarak kurulmuştur. Bu antiteler, İBH9’un patogenezini anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunmuş ve kişiselleştirilmiş tıp için yeni fırsatlar açmıştır. Kolonoidler veya kolondan kök hücre türevi, kendi kendini organize eden doku kültürleri, bağırsak kriptlerinde bulunan kök hücrelerin süresiz olarak yayılmasına ve muhafaza edilmesine izin veren bir süreçte hem murin hem de insan dokusundan geliştirilmiştir10. Kök hücre nişi in vivo büyümesini desteklemek için hücre dışı faktörlere, özellikle kanonik Wnt sinyaline ve kemik-morfojenik protein sinyal yollarınadayanır 11. Bu faktörlerin eklenmesi, kolonoidlerin sağlığını ve uzun ömürlülüğünü destekler, ancak aynı zamanda kültürü, hem kendi kendini yenileyen hem de terminal olarak farklılaşmış hücrelerden oluşan in vivo epitelyal hücresel mimariyi yansıtmayan kök hücre benzeri bir duruma doğru yönlendirir12,13. Bağırsak epitelinin işlevselliği, kök hücre bölmesi ile farklılaşmış hücreler arasındaki sürekli karışmaya bağlı olsa da, bir kolonoid kültür sisteminde her ikisine de sahip olma yeteneği oldukça sınırlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, organoid kültür sistemi, epitelin içsel özelliklerini ex vivo olarak incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, eldeki bilimsel soruyu cevaplamak için alternatif kültür stratejilerinin düşünülmesi gerekebilir.
Sürekli 7 günlük bir dekstran sodyum sülfat (DSS) rejimindeki farelerin hem epitel iltihabı hem de bariyer disfonksiyonu geliştirdiğigösterilmiştir 14. Ayrıca, insan IBD’sinde belirgin olduğu gösterilen mitokondriyal biyogenez yetmezliği ve bağırsak epitelinde metabolik yeniden programlama da bu DSS kolit15 modelinde yakalanmıştır. Bununla birlikte, ön verilerimiz, mitokondriyal biyogenez başarısızlığının özelliklerinin, DSS ile tedavi edilen hayvanların kriptlerinden türetilen kolonoidlerde korunmadığını göstermektedir (Ek Şekil 1). Bu nedenle, inflamasyonun murin bağırsak iltihabı sırasında epitel değişikliklerini nasıl yönlendirdiğini incelerken alternatif kültür yöntemleri kullanılmalıdır. Burada, 1) murin kolonoidlerinin kurulması için tüm kolon dokusundan kriptlerin nasıl izole edileceğini, 2) hücre popülasyonunu in vivo olarak yansıtmak için bu hücre popülasyonunun terminal olarak nasıl ayırt edileceğini ve 3) bu in vitro modelde inflamasyonun nasıl indükleneceğini açıklayan bir protokolü özetliyoruz. İltihaplı epitel içindeki ilaç etkileşimlerini incelemek için, temel olarak inflamatuar mediatörlerle tedavi edilebilen ve ilaç tedavileri ile apikal olarak tedavi edilebilen murin kolonoidlerinden 2-dimensonal (2D) tek tabakalar oluşturmak için bir protokol geliştirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoid gelişimi, bilimsel topluluğun organ sistemlerini in vitro olarak inceleme biçiminde devrim yarattı ve hücresel yapıyı ve işlevi bir tabaktaki bir hayvandan veya insandan kısmen özetleme yeteneği ile değiştirdi. Ayrıca, hastalıkları olan insanlardan elde edilen organoid sistemler, terapötik karar verme sürecine rehberlik edebilecek kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir araç sunmaktadır. Burada, iyi çalışan bir kript izolasyon protokolünü açıklıyoruz ve kaplamadan ö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe R01DK120986 (KPM’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).
