חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים
Summary
אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.
Abstract
אפיתל המעי ממלא תפקיד חיוני בבריאות האדם, ומספק מחסום בין המארח לסביבה החיצונית. שכבת תאים דינמית מאוד זו מספקת את קו ההגנה הראשון בין אוכלוסיות מיקרוביאליות וחיסוניות ומסייעת לווסת את התגובה החיסונית של המעי. הפרעה במחסום האפיתל היא סימן היכר של מחלות מעי דלקתיות (IBD) והיא מעניינת למיקוד טיפולי. מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא מודל שימושי ביותר במבחנה לחקר דינמיקה של תאי גזע במעי ופיזיולוגיה של תאי אפיתל בפתוגנזה של IBD. באופן אידיאלי, הקמת קולונואידים מרקמת אפיתל דלקתית של בעלי חיים תהיה מועילה ביותר בהערכת ההשפעות הגנטיות והמולקולריות על מחלות. עם זאת, הראינו כי שינויים באפיתל in vivo אינם נשמרים בהכרח בקולונואידים שנוצרו מעכברים עם דלקת חריפה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו פרוטוקול לטיפול בקולונואידים עם קוקטייל של מתווכי דלקת שבדרך כלל מוגברים במהלך IBD. בעוד שמערכת זו יכולה להיות מיושמת בכל מקום בתנאי תרבית שונים, פרוטוקול זה שם דגש על טיפול הן בקולונואידים מובחנים והן במונושכבות דו-ממדיות הנגזרות מקולונואידים מבוססים. בסביבת תרבית מסורתית, קולונואידים מועשרים בתאי גזע של המעי, ומספקים סביבה אידיאלית לחקר נישת תאי הגזע. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת ניתוח של התכונות של הפיזיולוגיה של המעי, כגון תפקוד המחסום. יתר על כן, קולונואידים מסורתיים אינם מציעים את ההזדמנות לחקור את התגובה התאית של תאי אפיתל ממוינים סופניים לגירויים מעודדי דלקת. השיטות המוצגות כאן מספקות מסגרת ניסויית חלופית להתמודדות עם מגבלות אלה. מערכת התרבית החד-שכבתית הדו-ממדית מציעה גם הזדמנות לבדיקת תרופות טיפוליות ex vivo. שכבת תאים מקוטבת זו יכולה להיות מטופלת עם מתווכי דלקת בצד הבסיסי של התא ובמקביל עם טיפולים משוערים כדי לקבוע את התועלת שלהם בטיפול ב- IBD.
Introduction
מחלת מעי דלקתית (IBD) היא מחלה כרונית, הפוגתית והתקפית המאופיינת באפיזודות של דלקת ושקט קליני. האטיולוגיה של IBD היא רב-גורמית, אך מאפיינים אופייניים עיקריים של המחלה כוללים תפקוד מחסום פגום וחדירות מוגברת של אפיתל המעי, בנוסף למפל איתות פרו-דלקתי המופעל בתוך תא האפיתל 1,2. מספר מודלים במבחנה ו-in vivo שימשו לשחזור תגובת האפיתל במהלך IBD, כולל תרבית תאים ומודלים של דלקת3. עם זאת, לכל המערכות הללו יש חסרונות חשובים המגבילים את יכולתן לשחזר את שינויי האפיתל במהלך IBD4. רוב קווי התאים המשמשים לחקר IBD עוברים טרנספורמציה, יש להם את היכולת ליצור monolayer, והוא יכול להתמיין3 אבל באופן מהותי להתפשט באופן שונה מאשר תאי אפיתל מעיים שאינם מותמרים בפונדקאי. מספר מודלים שונים של דלקת משמשים לחקר IBD, חלקם כוללים מודלים נוקאאוט, מודלים זיהומיים, מודלים דלקתיים כימיים, ומודלים להעברת תאי T 5,6,7,8. בעוד שכל אחד מהם יכול לחקור היבטים אטיולוגיים מסוימים של IBD, כגון נטייה גנטית, תפקוד לקוי של מחסומים, דה-רגולציה חיסונית והמיקרוביום, הם מוגבלים ביכולתם לחקור את האופי הרב-גורמי של המחלה.
אורגנואידים במעי, כולל אנטרואידים וקולונואידים, הוקמו בעשור האחרון כמודל מבחנה שימושי לחקר לא רק הדינמיקה של תאי גזע במעי, אלא גם תפקידם, שלמות המחסום ותפקודו של אפיתל המעי לשחק בהומאוסטזיס מעיים ומחלות. גופים אלה תרמו באופן משמעותי להבנתנו את הפתוגנזה של IBD9 ופתחו הזדמנויות חדשות לרפואה מותאמת אישית. קולונואידים, או תרביות רקמה שמקורן בתאי גזע ומארגנות את עצמן מהמעי הגס, פותחו הן מרקמת מורין והן מרקמה אנושית בתהליך המאפשר לתאי גזע הממוקמים בתוך קריפטות מעיים להתרבות ולהישמר ללא הגבלת זמן10. נישת תאי הגזע in vivo מסתמכת על גורמים חוץ-תאיים כדי לתמוך בצמיחתה, בעיקר איתות Wnt הקנוני ומסלולי איתות חלבונים מורפוגנייםעצם 11. התוספת של גורמים אלה מקדמת את בריאותם ואריכות ימיהם של קולונואידים, אך גם מניעה את התרבית לעבר מצב דמוי תאי גזע שאינו משקף את ארכיטקטורת תאי האפיתל in vivo, המורכבת מתאים המתחדשים מעצמם וממוינים סופניים12,13. בעוד שהפונקציונליות של אפיתל המעי תלויה ביחסי הגומלין המתמשכים בין תא תאי הגזע לבין תאים ממוינים, היכולת להחזיק את שניהם במערכת תרבית קולונואידים מוגבלת למדי. למרות מגבלות אלה, מערכת תרבית האורגנואידים נותרה תקן הזהב לחקר התכונות המהותיות של אפיתל ex vivo. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לשקול אסטרטגיות תרבות חלופיות כדי לענות על השאלה המדעית שעל הפרק.
הוכח כי עכברים במשטר מתמשך של 7 ימים של דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) מפתחים דלקת אפיתל ותפקוד לקוי של מחסום14. יתר על כן, כישלון ביוגנזה מיטוכונדריאלית ותכנות מחדש מטבולי בתוך אפיתל המעי, אשר הוכחו כניכרים ב- IBD אנושי, נלכדו גם במודל DSS זה של קוליטיס15. אולם הנתונים הראשוניים שלנו מראים שהמאפיינים של כשל ביוגנזה מיטוכונדריאלית אינם נשמרים בקולונואידים שמקורם בקריפטות של חיות שטופלו ב-DSS (איור משלים 1). לכן, יש להשתמש בשיטות תרבית חלופיות כאשר בוחנים כיצד דלקת מניעה שינויים אפיתל במהלך דלקת מעיים מורין. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו המתאר 1) כיצד לבודד קריפטות מרקמת המעי הגס כולה לצורך הקמת קולונואידים מורינים, 2) כיצד להבדיל אוכלוסיית תאים זו באופן סופי כך שתשקף את אוכלוסיית התאים כפי שהיא עומדת in vivo, ו-3) כיצד לגרום לדלקת במודל זה במבחנה . כדי לחקור אינטראקציות בין תרופתיות בתוך האפיתל המודלק, פיתחנו פרוטוקול לביסוס מונושכבות דו-ממדיות (2-dimensonal) מקולונואידים מורינים שניתן לטפל בהם באופן בסיסי עם מתווכים דלקתיים ולטפל בהם באופן אפי באמצעות טיפולים תרופתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתוח אורגנואידים חולל מהפכה באופן שבו הקהילה המדעית חוקרת מערכות איברים במבחנה עם היכולת לשחזר חלקית את המבנה והתפקוד התאי מבעל חיים או אדם בצלחת. יתר על כן, מערכות אורגנואידים שמקורן בבני אדם עם מחלות מציעות כלי מבטיח לרפואה מותאמת אישית שיכול להנחות קבלת החלטות טיפוליות. כאן, אנו ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים למענקי בריאות R01DK120986 (ל- K.P.M).
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).
