Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden
Summary
We beschrijven een protocol dat de isolatie van murine coloncrypten beschrijft voor de ontwikkeling van 3-dimensionale colonoïden. De gevestigde colonoïden kunnen vervolgens terminaal worden gedifferentieerd om de cellulaire samenstelling van het gastheerepitheel weer te geven voordat ze een ontstekingsuitdaging krijgen of worden gericht op het vaststellen van een epitheliale monolaag.
Abstract
Het darmepitheel speelt een essentiële rol in de menselijke gezondheid en vormt een barrière tussen de gastheer en de externe omgeving. Deze zeer dynamische cellaag vormt de eerste verdedigingslinie tussen microbiële en immuunpopulaties en helpt de intestinale immuunrespons te moduleren. Verstoring van de epitheliale barrière is een kenmerk van inflammatoire darmziekte (IBD) en is van belang voor therapeutische targeting. Het 3-dimensionale colonoïde cultuursysteem is een uiterst nuttig in vitro model voor het bestuderen van intestinale stamceldynamica en epitheelcelfysiologie in IBD-pathogenese. Idealiter zou het vestigen van colonoïden uit het ontstoken epitheelweefsel van dieren het meest gunstig zijn bij het beoordelen van de genetische en moleculaire invloeden op ziekten. We hebben echter aangetoond dat in vivo epitheliale veranderingen niet noodzakelijkerwijs worden behouden in colonoïden die zijn vastgesteld bij muizen met acute ontsteking. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om colonoïden te behandelen met een cocktail van ontstekingsmediatoren die meestal verhoogd zijn tijdens IBD. Hoewel dit systeem alomtegenwoordig kan worden toegepast op verschillende kweekomstandigheden, benadrukt dit protocol de behandeling van zowel gedifferentieerde colonoïden als 2-dimensionale monolagen afgeleid van gevestigde colonoïden. In een traditionele kweekomgeving worden colonoïden verrijkt met darmstamcellen, wat een ideale omgeving biedt om de stamcelniche te bestuderen. Dit systeem laat echter geen analyse toe van de kenmerken van de darmfysiologie, zoals de barrièrefunctie. Verder bieden traditionele colonoïden niet de mogelijkheid om de cellulaire respons van terminaal gedifferentieerde epitheelcellen op pro-inflammatoire stimuli te bestuderen. De hier gepresenteerde methoden bieden een alternatief experimenteel kader om deze beperkingen aan te pakken. Het 2-dimensionale monolaagse kweeksysteem biedt ook de mogelijkheid voor therapeutische geneesmiddelenscreening ex vivo. Deze gepolariseerde laag cellen kan worden behandeld met ontstekingsmediatoren aan de basale kant van de cel en gelijktijdig met vermeende therapieën apisch om hun nut bij IBD-behandeling te bepalen.
Introduction
Inflammatoire darmziekte (IBD) is een chronische, remitterende en recidiverende ziekte die wordt gekenmerkt door episodes van ontsteking en klinische rust. De etiologie van IBD is multifactorieel, maar belangrijke kenmerkende kenmerken van de ziekte zijn een defecte barrièrefunctie en verhoogde permeabiliteit van het darmepitheel, naast pro-inflammatoire signaalcascades geactiveerd in het epitheelcompartiment 1,2. Verschillende in vitro en in vivo modellen zijn gebruikt om de epitheliale respons tijdens IBD samen te vatten, waaronder celkweek en muizenmodellen van ontsteking3. Al deze systemen hebben echter belangrijke tekortkomingen die hun vermogen beperken om de epitheliale veranderingen tijdens IBD4 samen te vatten. De meeste cellijnen die worden gebruikt om IBD te bestuderen, zijn getransformeerd, hebben het vermogen om een monolaag te vormen en kunnen3 onderscheiden, maar zich intrinsiek anders voortplanten dan niet-getransformeerde darmepitheelcellen in de gastheer. Verschillende muizenmodellen van ontsteking worden gebruikt om IBD te bestuderen, waarvan sommige knock-outmodellen, infectieuze modellen, chemische ontstekingsmodellen en T-celoverdrachtsmodellen 5,6,7,8 omvatten. Hoewel elk bepaalde etiologische aspecten van IBD kan bestuderen, zoals genetische aanleg, barrièredisfunctie, immuunderegulatie en het microbioom, zijn ze beperkt in hun vermogen om de multifactoriële aard van de ziekte te bestuderen.
Intestinale organoïden, waaronder enteroïden en colonoïden, zijn het afgelopen decennium vastgesteld als een nuttig in vitro model voor het bestuderen van niet alleen de dynamiek van intestinale stamcellen, maar ook hun rol de barrière-integriteit en functie van het darmepitheel spelen in intestinale homeostase en ziekte. Deze entiteiten hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de pathogenese van IBD9 en hebben nieuwe mogelijkheden geopend voor gepersonaliseerde geneeskunde. Colonoïden, of stamcel-afgeleide, zelforganiserende weefselculturen uit de dikke darm, zijn ontwikkeld uit zowel murine als menselijk weefsel in een proces dat stamcellen in darmcrypten in staat stelt zich te verspreiden en voor onbepaalde tijd te worden onderhouden10. De stamcelniche in vivo is afhankelijk van extracellulaire factoren om de groei ervan te ondersteunen, met name de canonieke Wnt-signalering en botmorfogene eiwitsignaleringsroutes11. De toevoeging van deze factoren bevordert de gezondheid en levensduur van colonoïden, maar drijft de cultuur ook naar een stamcelachtige toestand die geen weerspiegeling is van de in vivo epitheliale cellulaire architectuur, die bestaat uit zowel zelfvernieuwende als terminaal gedifferentieerde cellen12,13. Hoewel de functionaliteit van het darmepitheel afhankelijk is van de voortdurende overspraak tussen het stamcelcompartiment en gedifferentieerde cellen, is het vermogen om beide in een colonoïde kweeksysteem te hebben vrij beperkt. Ondanks deze beperkingen blijft het organoïde cultuursysteem de gouden standaard om de intrinsieke eigenschappen van het epitheel ex vivo te bestuderen. Niettemin moeten alternatieve cultuurstrategieën mogelijk worden overwogen om de wetenschappelijke vraag te beantwoorden.
Het is aangetoond dat muizen op een continu 7-daags regime van dextransonnatriumsulfaat (DSS) zowel epitheliale ontsteking als barrièredisfunctie ontwikkelen14. Bovendien zijn mitochondriaal biogenesefalen en metabole herprogrammering binnen het darmepitheel, waarvan is aangetoond dat ze duidelijk zijn bij menselijke IBD, ook vastgelegd in dit DSS-model van colitis15. Onze voorlopige gegevens tonen echter aan dat de kenmerken van mitochondriaal biogenesefalen niet behouden blijven in colonoïden die zijn afgeleid van de crypten van met DSS behandelde dieren (aanvullende figuur 1). Daarom moeten alternatieve kweekmethoden worden gebruikt bij het onderzoeken hoe ontsteking epitheliale veranderingen veroorzaakt tijdens muriene darmontsteking. Hier schetsen we een protocol dat we hebben ontwikkeld dat beschrijft 1) hoe crypten te isoleren van heel colonweefsel voor de oprichting van muriene colonoïden, 2) hoe deze celpopulatie terminaal te differentiëren om de celpopulatie weer te geven zoals deze in vivo staat, en 3) hoe ontsteking te induceren in dit in vitro model. Om geneesmiddelinteracties binnen het ontstoken epitheel te bestuderen, hebben we een protocol ontwikkeld om 2-dimensonale (2D) monolagen van murine colonoïden vast te stellen die basaal kunnen worden behandeld met ontstekingsmediatoren en apisch kunnen worden behandeld met medicamenteuze therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van organoïden heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop de wetenschappelijke gemeenschap orgaansystemen in vitro bestudeert met het vermogen om de cellulaire structuur en functie van een dier of mens gedeeltelijk in een schaal samen te vatten. Verder bieden organoïde systemen afgeleid van mensen met ziekten een veelbelovend hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde die therapeutische besluitvorming zou kunnen begeleiden. Hier beschrijven we een crypte-isolatieprotocol dat goed…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DK120986 (aan K.P.M.).
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).
