Nous décrivons un protocole détaillant l’isolement des cryptes coliques murines pour le développement de colonoïdes en 3 dimensions. Les colonoïdes établis peuvent ensuite être différenciés en phase terminale pour refléter la composition cellulaire de l’épithélium hôte avant de recevoir un défi inflammatoire ou d’être dirigés vers l’établissement d’une monocouche épithéliale.
L’épithélium intestinal joue un rôle essentiel dans la santé humaine, fournissant une barrière entre l’hôte et l’environnement extérieur. Cette couche cellulaire très dynamique fournit la première ligne de défense entre les populations microbiennes et immunitaires et aide à moduler la réponse immunitaire intestinale. La perturbation de la barrière épithéliale est une caractéristique de la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) et présente un intérêt pour le ciblage thérapeutique. Le système de culture colonoïde en 3 dimensions est un modèle in vitro extrêmement utile pour étudier la dynamique des cellules souches intestinales et la physiologie des cellules épithéliales dans la pathogenèse des MII. Idéalement, l’établissement de colonoïdes à partir du tissu épithélial enflammé des animaux serait le plus bénéfique pour évaluer les influences génétiques et moléculaires sur la maladie. Cependant, nous avons montré que les changements épithéliaux in vivo ne sont pas nécessairement retenus chez les colonoïdes établis à partir de souris présentant une inflammation aiguë. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé un protocole pour traiter les colonoïdes avec un cocktail de médiateurs inflammatoires qui sont généralement élevés pendant les MII. Bien que ce système puisse être appliqué de manière omniprésente à diverses conditions de culture, ce protocole met l’accent sur le traitement à la fois sur les colonoïdes différenciés et sur les monocouches à 2 dimensions dérivées de colonoïdes établis. Dans un environnement de culture traditionnel, les colonoïdes sont enrichis en cellules souches intestinales, offrant un environnement idéal pour étudier la niche des cellules souches. Cependant, ce système ne permet pas une analyse des caractéristiques de la physiologie intestinale, telles que la fonction de barrière. De plus, les colonoïdes traditionnels n’offrent pas la possibilité d’étudier la réponse cellulaire des cellules épithéliales différenciées en phase terminale aux stimuli pro-inflammatoires. Les méthodes présentées ici fournissent un cadre expérimental alternatif pour remédier à ces limitations. Le système de culture monocouche en 2 dimensions offre également la possibilité de cribler des médicaments thérapeutiques ex vivo. Cette couche polarisée de cellules peut être traitée avec des médiateurs inflammatoires sur la face basale de la cellule et en concomitance avec des thérapies putatives apicalement pour déterminer leur utilité dans le traitement des MII.
La maladie inflammatoire de l’intestin (MII) est une maladie chronique, rémittente et récurrente caractérisée par des épisodes d’inflammation et de quiescence clinique. L’étiologie de la MII est multifactorielle, mais les principales caractéristiques de la maladie comprennent une fonction de barrière défectueuse et une perméabilité accrue de l’épithélium intestinal, en plus des cascades de signalisation pro-inflammatoires activées dans le compartiment épithélial 1,2. Plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été utilisés pour récapituler la réponse épithéliale au cours de la MII, y compris la culture cellulaire et les modèles murins de l’inflammation3. Cependant, tous ces systèmes présentent des lacunes importantes qui limitent leur capacité à récapituler les changements épithéliaux au cours de la MII4. La plupart des lignées cellulaires utilisées pour étudier les MII sont transformées, ont la capacité de former une monocouche et peuvent différencier3 mais se propagent intrinsèquement différemment des cellules épithéliales intestinales non transformées de l’hôte. Plusieurs modèles murins différents de l’inflammation sont utilisés pour étudier les MII, dont certains comprennent des modèles knock-out, des modèles infectieux, des modèles inflammatoires chimiques et des modèles de transfert de lymphocytes T 5,6,7,8. Bien que chacun puisse étudier certains aspects étiologiques des MII, tels que les prédispositions génétiques, le dysfonctionnement de la barrière, la dérégulation immunitaire et le microbiome, ils sont limités dans leur capacité à étudier la nature multifactorielle de la maladie.
Les organoïdes intestinaux, y compris les entéroïdes et les colonoïdes, ont été établis au cours de la dernière décennie comme un modèle in vitro utile pour étudier non seulement la dynamique des cellules souches intestinales, mais aussi leur rôle dans l’intégrité de la barrière et la fonction de l’épithélium intestinal dans l’homéostasie et la maladie intestinales. Ces entités ont contribué de manière significative à notre compréhension de la pathogenèse de la MII9 et ont ouvert de nouvelles possibilités pour la médecine personnalisée. Des colonoïdes, ou des cultures tissulaires auto-organisées dérivées de cellules souches du côlon, ont été développées à partir de tissus murins et humains dans un processus qui permet aux cellules souches situées dans les cryptes intestinales de se propager et d’être maintenues indéfiniment10. La niche des cellules souches in vivo s’appuie sur des facteurs extracellulaires pour soutenir sa croissance, notamment les voies canoniques de signalisation Wnt et de signalisation des protéines morphogéniquesosseuses 11. L’ajout de ces facteurs favorise la santé et la longévité des colonoïdes, mais conduit également la culture vers un état semblable à celui des cellules souches qui ne reflète pas l’architecture cellulaire épithéliale in vivo, qui se compose à la fois de cellules auto-renouvelées et de cellules différenciées en phase terminale12,13. Alors que la fonctionnalité de l’épithélium intestinal dépend de la diaphonie continue entre le compartiment des cellules souches et les cellules différenciées, la capacité d’avoir les deux dans un système de culture colonoïde est assez limitée. Malgré ces limites, le système de culture organoïde reste l’étalon-or pour étudier les propriétés intrinsèques de l’épithélium ex vivo. Néanmoins, il peut être nécessaire d’envisager des stratégies culturales alternatives pour répondre à la question scientifique en question.
Il a été démontré que les souris suivant un régime continu de 7 jours de sulfate de sodium de dextrane (DSS) développent à la fois une inflammation épithéliale et un dysfonctionnement de la barrière14. De plus, l’échec de la biogenèse mitochondriale et la reprogrammation métabolique dans l’épithélium intestinal, qui se sont révélés évidents dans les MII humaines, ont également été capturés dans ce modèle DSS de colite15. Cependant, nos données préliminaires démontrent que les caractéristiques de l’échec de la biogenèse mitochondriale ne sont pas retenues chez les colonoïdes dérivés des cryptes des animaux traités par DSS (Figure supplémentaire 1). Ainsi, des méthodes de culture alternatives doivent être utilisées lors de l’examen de la façon dont l’inflammation entraîne des changements épithéliaux au cours de l’inflammation intestinale murine. Ici, nous décrivons un protocole que nous avons développé qui décrit 1) comment isoler les cryptes du tissu colique entier pour l’établissement de colonoïdes murins, 2) comment différencier définitivement cette population cellulaire pour refléter la population cellulaire telle qu’elle se présente in vivo, et 3) comment induire une inflammation dans ce modèle in vitro . Pour étudier les interactions médicamenteuses au sein de l’épithélium enflammé, nous avons développé un protocole pour établir des monocouches 2-dimensonales (2D) à partir de colonoïdes murins qui peuvent être traités de manière basale avec des médiateurs inflammatoires et traités apiquement avec des thérapies médicamenteuses.
Le développement organoïde a révolutionné la façon dont la communauté scientifique étudie les systèmes d’organes in vitro avec la capacité de récapituler partiellement la structure cellulaire et la fonction d’un animal ou d’un humain dans une boîte. De plus, les systèmes organoïdes dérivés de maladies humaines offrent un outil prometteur pour la médecine personnalisée qui pourrait guider la prise de décision thérapeutique. Ici, nous décrivons un protocole d’isolation de crypte qui fon…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grants R01DK120986 (à K.P.M.).
0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |