確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する
Summary
3次元コロノイドの発生のためのマウス結腸陰窩の単離を詳述するプロトコルについて説明します。その後、確立されたコロノイドは、炎症性チャレンジを受ける前、または上皮単層を確立するように指示される前に、宿主上皮の細胞組成を反映するように最終分化され得る。
Abstract
腸上皮は人間の健康に不可欠な役割を果たし、宿主と外部環境の間に障壁を提供します。この非常に動的な細胞層は、微生物集団と免疫集団の間の最初の防衛線を提供し、腸の免疫応答を調節するのに役立ちます。上皮バリアの破壊は炎症性腸疾患(IBD)の特徴であり、治療標的化に関心があります。3次元コロノイド培養系は、IBDの病態における腸幹細胞動態と上皮細胞生理を研究するための非常に有用な in vitro モデルです。理想的には、動物の炎症を起こした上皮組織からコロノイドを確立することは、疾患に対する遺伝的および分子的影響を評価するのに最も有益であろう。しかし、我々は、急性炎症マウスから樹立されたコロノイドにおいて 、in vivo 上皮変化が必ずしも保持されないことを示した。この制限に対処するために、IBD中に通常上昇する炎症メディエーターのカクテルでコロノイドを治療するためのプロトコルを開発しました。このシステムはさまざまな培養条件に遍在的に適用できますが、このプロトコルは、分化したコロノイドと確立されたコロノイドに由来する2次元単層の両方の処理に重点を置いています。従来の培養環境では、コロノイドは腸幹細胞が豊富であり、幹細胞ニッチを研究するのに理想的な環境を提供します。しかし、このシステムでは、バリア機能などの腸管生理の特徴を分析することはできません。さらに、伝統的なコロノイドは、炎症誘発性刺激に対する最終分化上皮細胞の細胞応答を研究する機会を提供しない。ここで紹介する方法は、これらの制限に対処するための代替実験フレームワークを提供します。2次元単層培養システムは、 ex vivoでの治療薬スクリーニングの機会も提供します。この細胞の分極層は、細胞の基底側の炎症メディエーターで治療することができ、IBD治療におけるそれらの有用性を決定するために、頂端的に推定治療薬と併用することができる。
Introduction
炎症性腸疾患(IBD)は、炎症と臨床的静止のエピソードを特徴とする慢性の寛解型および再発性疾患です。IBDの病因は多因子性ですが、この疾患の重要な特徴には、上皮コンパートメント内で活性化される炎症誘発性シグナル伝達カスケードに加えて、バリア機能の欠陥と腸上皮の透過性の増加が含まれます1,2。IBD中の上皮応答を再現するために、細胞培養および炎症のマウスモデルを含むいくつかのインビトロおよびインビボモデルが使用されてきた3。しかしながら、これらのシステムはすべて、IBD4中の上皮変化を再現する能力を制限する重要な欠点を有する。IBDの研究に使用されるほとんどの細胞株は形質転換され、単層を形成する能力を有し、分化することができるが3、宿主における非形質転換腸上皮細胞とは異なる性質の増殖を行う。炎症のいくつかの異なるマウスモデルがIBDの研究に使用され、そのうちのいくつかには、ノックアウトモデル、感染モデル、化学炎症モデル、およびT細胞移植モデルが含まれます5、6、7、8。それぞれが遺伝的素因、バリア機能障害、免疫調節解除、微生物叢など、IBDの特定の病因学的側面を研究することができますが、病気の多因子性を研究する能力には制限があります。
エンテロイドやコロノイドを含む腸管オルガノイドは、腸幹細胞の動態だけでなく、腸管上皮のバリア完全性と機能が腸の恒常性と疾患に果たす役割を研究するための有用なin vitroモデルとして過去10年間にわたって確立されてきました。これらのエンティティは、IBD9の病因の理解に大きく貢献し、個別化医療の新しい機会を開きました。コロノイド、または結腸からの幹細胞由来の自己組織化組織培養物は、腸陰窩内にある幹細胞が増殖し、無期限に維持されることを可能にするプロセスにおいて、マウスとヒトの両方の組織から開発されました10。in vivoの幹細胞ニッチは、その成長をサポートするために細胞外因子、特に標準的なWntシグナル伝達および骨形態形成タンパク質シグナル伝達経路に依存しています11。これらの因子の添加は、コロノイドの健康と寿命を促進するだけでなく、自己複製細胞と最終分化細胞の両方で構成されるin vivo上皮細胞構造を反映しない幹細胞様状態に向けて培養を推進します12,13。腸上皮の機能は、幹細胞コンパートメントと分化細胞との間の継続的なクロストークに依存しているが、コロノイド培養系において両方を有する能力はかなり限られている。これらの制限にもかかわらず、オルガノイド培養システムは、ex vivoで上皮の固有の特性を研究するためのゴールドスタンダードであり続けています。それにもかかわらず、目前の科学的質問に答えるために、代替文化戦略を検討する必要があるかもしれません。
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の連続7日間レジメンのマウスは、上皮性炎症とバリア機能障害の両方を発症することが示されています14。さらに、ヒトIBDで明らかであることが示されている腸上皮内のミトコンドリア生合成障害および代謝リプログラミングも、この大腸炎のDSSモデルで捕捉されています15。しかし、我々の予備データは、ミトコンドリア生合成障害の特徴がDSS処理動物の陰窩に由来するコロノイドでは保持されていないことを示しています(補足図1)。したがって、マウス腸の炎症中に炎症がどのように上皮の変化を引き起こすかを調べる際には、代替培養法を使用する必要があります。ここでは、1)マウスコロノイドの樹立のために結腸組織全体から陰窩を分離する方法、2)この細胞集団をin vivoでの細胞集団を反映するように最終分化させる方法、および3)この in vitro モデルで炎症を誘発する方法を説明する、私たちが開発したプロトコルの概要を説明します。炎症上皮内の薬物相互作用を研究するために、炎症メディエーターで基本的に治療し、薬物療法で根尖的に治療できるマウスコロノイドから2次元(2D)単層を確立するためのプロトコルを開発しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
オルガノイドの開発は、科学界がin vitro で臓器系を研究する方法に革命をもたらし、皿の中の動物または人間の細胞構造と機能を部分的に再現する能力を備えています。さらに、疾患を持つヒトに由来するオルガノイドシステムは、治療上の意思決定を導く可能性のある個別化医療のための有望なツールを提供します。ここでは、適切に機能する暗号分離プロトコルについて説明し、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、国立衛生研究所助成金R01DK120986(K.P.M.へ)によって支援されました。
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
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