확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구
Summary
우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.
Abstract
장 상피는 인체 건강에 필수적인 역할을 하며 숙주와 외부 환경 사이에 장벽을 제공합니다. 이 매우 역동적인 세포층은 미생물과 면역 집단 사이의 첫 번째 방어선을 제공하고 장 면역 반응을 조절하는 데 도움이 됩니다. 상피 장벽의 파괴는 염증성 장 질환(IBD)의 특징이며 치료 표적화에 관심이 있습니다. 3차원 결장 배양 시스템은 IBD 발병기전에서 장 줄기 세포 역학 및 상피 세포 생리학을 연구하는 데 매우 유용한 시험관 내 모델입니다. 이상적으로는 동물의 염증이 있는 상피 조직에서 콜로노이드를 확립하는 것이 질병에 대한 유전적 및 분자적 영향을 평가하는 데 가장 유익할 것입니다. 그러나, 우리는 생체 내 상피 변화가 급성 염증이 있는 마우스에서 확립된 콜로노이드에서 반드시 유지되는 것은 아니라는 것을 보여주었습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 IBD 동안 일반적으로 상승하는 염증 매개체의 칵테일로 콜로노이드를 치료하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 시스템은 다양한 배양 조건에 유비쿼터스로 적용될 수 있지만, 이 프로토콜은 차별화된 콜로노이드와 확립된 콜로노이드에서 파생된 2차원 단층 모두에 대한 처리를 강조합니다. 전통적인 배양 환경에서 콜로노이드는 장내 줄기 세포가 풍부하여 줄기 세포 틈새를 연구하기에 이상적인 환경을 제공합니다. 그러나 이 시스템은 장벽 기능과 같은 장 생리학의 특징을 분석할 수 없습니다. 또한, 전통적인 콜로노이드는 전염증성 자극에 대한 말단적으로 분화된 상피 세포의 세포 반응을 연구할 기회를 제공하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 이러한 제한 사항을 해결하기 위한 대체 실험 프레임워크를 제공합니다. 2차원 단층 배양 시스템은 또한 생체 외에서 치료 약물 스크리닝을 위한 기회를 제공합니다. 이 편광된 세포층은 세포의 기저부에 있는 염증 매개체로 치료할 수 있으며 IBD 치료에서의 유용성을 결정하기 위해 정점적으로 추정 치료제와 병행할 수 있습니다.
Introduction
염증성 장 질환(IBD)은 염증 및 임상적 정지 에피소드를 특징으로 하는 만성, 완화 및 재발성 질환입니다. IBD의 병인은 다인성이지만, 이 질환의 주요 특징은 상피 구획 내에서 활성화된 전염증성 신호 캐스케이드 외에도 장벽 기능 결함과 장 상피의 투과성 증가를 포함한다 1,2. 염증의 세포 배양 및 쥐 모델을 포함하여 IBD 동안 상피 반응을 요약하기 위해 여러 시험관 내 및 생체 내 모델이 사용되었습니다3. 그러나, 이들 모든 시스템은 IBD4 동안 상피 변화를 요약하는 능력을 제한하는 중요한 단점을 가지고 있다. IBD 연구에 사용되는 대부분의 세포주는 형질전환되고, 단층을 형성할 수 있는 능력을 가지며,3개를 분화시킬 수 있지만 숙주에서 형질전환되지 않은 장 상피 세포와 본질적으로 다르게 증식합니다. 염증의 여러 다른 쥐 모델이 IBD를 연구하는 데 사용되며, 그 중 일부는 녹아웃 모델, 감염성 모델, 화학적 염증 모델 및 T 세포 전달 모델 5,6,7,8을 포함합니다. 각각은 유전적 소인, 장벽 기능 장애, 면역 조절 완화 및 미생물군집과 같은 IBD의 특정 병인학적 측면을 연구할 수 있지만 질병의 다인성 특성을 연구하는 능력에는 한계가 있습니다.
엔테로이드 및 콜로노이드를 포함한 장 오가노이드는 지난 10년 동안 장 줄기 세포의 역학뿐만 아니라 장 항상성 및 질병에서 장 상피의 역할, 장벽 무결성 및 기능을 연구하기 위한 유용한 시험관 내 모델로 확립되었습니다. 이러한 실체는 IBD9의 발병기전에 대한 우리의 이해에 크게 기여했으며 개인화된 의학을 위한 새로운 기회를 열었습니다. 대장에서 줄기 세포 유래 자가 조직화 배양물인 콜로노이드(Colonoids)는 쥐와 인간 조직 모두에서 개발되어 장 선와(intestinal crypt) 내에 위치한 줄기세포가 번식하고 무기한 유지될 수 있도록 하는 과정이다10. 생체 내 줄기 세포 틈새는 성장을 지원하기 위해 세포외 인자, 특히 표준 Wnt 신호 전달 및 뼈 형태 형성 단백질 신호 전달 경로에 의존합니다11. 이러한 인자의 추가는 콜로노이드의 건강과 수명을 촉진할 뿐만 아니라 자가 재생 세포와 말단 분화 세포 모두로 구성된 생체 내 상피 세포 구조를 반영하지 않는 줄기 세포와 유사한 상태로 배양을 유도합니다12,13. 장 상피의 기능은 줄기 세포 구획과 분화된 세포 사이의 지속적인 누화에 의존하지만, 결장 배양 시스템에서 둘 다를 갖는 능력은 상당히 제한적입니다. 이러한 한계에도 불구하고 오가노이드 배양 시스템은 생체 외 상피의 고유 특성을 연구하기 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 당면한 과학적 질문에 답하기 위해 대안적 문화 전략을 고려해야 할 수도 있습니다.
덱스트란 황산나트륨(DSS)을 7일 동안 지속적으로 투여한 쥐는 상피 염증과 장벽 기능 장애를 모두 발생시키는 것으로 나타났다14. 또한, 인간 IBD에서 명백한 것으로 밝혀진 장 상피 내의 미토콘드리아 생물 발생 실패 및 대사 재프로그래밍도 대장염의 DSS 모델에서도 포착되었습니다15. 그러나 우리의 예비 데이터는 미토콘드리아 생물 발생 실패의 특성이 DSS 처리 동물의 선와에서 파생된 콜로노이드에서 유지되지 않는다는 것을 보여줍니다(보충 그림 1). 따라서 쥐 장 염증 동안 염증이 상피 변화를 유발하는 방법을 조사할 때 대체 배양 방법을 사용해야 합니다. 여기에서 우리는 1) 쥐 콜로노이드의 확립을 위해 전체 결장 조직에서 선와를 분리하는 방법, 2) 생체 내 세포 집단을 반영하기 위해 이 세포 집단을 최종적으로 분화하는 방법, 3) 이 시험관 내 모델에서 염증을 유도하는 방법. 염증이 있는 상피 내에서 약물 상호작용을 연구하기 위해 우리는 염증 매개체로 기저적으로 치료하고 약물 요법으로 정점으로 치료할 수 있는 쥐 결장에서 2-디멘소날(2D) 단층을 설정하는 프로토콜을 개발했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오가노이드 개발은 과학계가 접시에 담긴 동물이나 인간의 세포 구조와 기능을 부분적으로 요약할 수 있는 능력으로 체외에서 장기 시스템을 연구하는 방식에 혁명을 일으켰습니다. 또한, 질병이 있는 인간에게서 파생된 오가노이드 시스템은 치료 의사 결정을 안내할 수 있는 개인화된 의학을 위한 유망한 도구를 제공합니다. 여기에서는 잘 작동하는 크립트 격리 프로토콜에 대해 설명하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 보조금 R01DK120986 (KPM에)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).
