Studere epiteleffekter av tarmbetennelse in vitro på etablerte murinkolonoider
Summary
Vi beskriver en protokoll som beskriver isolering av murine kolonkrypter for utvikling av 3-dimensjonale kolonoider. De etablerte kolonoidene kan deretter terminalt differensieres for å reflektere den cellulære sammensetningen av vertsepitelet før de mottar en inflammatorisk utfordring eller blir rettet mot å etablere et epitelmonolag.
Abstract
Tarmepitelet spiller en viktig rolle i menneskers helse, og gir en barriere mellom verten og det ytre miljø. Dette svært dynamiske cellelaget gir den første forsvarslinjen mellom mikrobielle og immunpopulasjoner og bidrar til å modulere den intestinale immunresponsen. Forstyrrelse av epitelbarrieren er et kjennetegn på inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og er av interesse for terapeutisk målretting. Det 3-dimensjonale kolonoidkultursystemet er en ekstremt nyttig in vitro-modell for å studere intestinal stamcelledynamikk og epitelcellefysiologi i IBD-patogenese. Ideelt sett ville etablering av kolonoider fra betent epitelvev av dyr være mest fordelaktig for å vurdere de genetiske og molekylære påvirkningene på sykdom. Vi har imidlertid vist at in vivo epitelforandringer ikke nødvendigvis beholdes i kolonoider etablert fra mus med akutt inflammasjon. For å løse denne begrensningen har vi utviklet en protokoll for å behandle kolonoider med en cocktail av inflammatoriske mediatorer som vanligvis er forhøyet under IBD. Selv om dette systemet kan brukes allestedsnærværende til forskjellige kulturforhold, legger denne protokollen vekt på behandling på både differensierte kolonoider og 2-dimensjonale monolayers avledet fra etablerte kolonoider. I en tradisjonell kulturinnstilling er kolonoider beriket med intestinale stamceller, noe som gir et ideelt miljø for å studere stamcellenisjen. Dette systemet tillater imidlertid ikke en analyse av funksjonene i tarmfysiologi, for eksempel barrierefunksjon. Videre tilbyr tradisjonelle kolonoider ikke muligheten til å studere den cellulære responsen av terminalt differensierte epitelceller til proinflammatoriske stimuli. Metodene som presenteres her gir et alternativt eksperimentelt rammeverk for å løse disse begrensningene. Det 2-dimensjonale monolagskultursystemet gir også en mulighet for terapeutisk legemiddelscreening ex vivo. Dette polariserte lag av celler kan behandles med inflammatoriske mediatorer på basalsiden av cellen og samtidig med antatte terapeutiske midler apikalt for å bestemme deres nytte i IBD-behandling.
Introduction
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en kronisk, remitterende og tilbakevendende sykdom preget av episoder av betennelse og klinisk hvile. Etiologien til IBD er multifaktoriell, men viktige karakteristiske trekk ved sykdommen inkluderer defekt barrierefunksjon og økt permeabilitet i tarmepitelet, i tillegg til proinflammatoriske signalkaskader aktivert i epitelrommet 1,2. Flere in vitro og in vivo modeller har blitt brukt til å rekapitulere epitelresponsen under IBD, inkludert cellekultur og murine modeller av betennelse3. Imidlertid har alle disse systemene viktige mangler som begrenser deres evne til å rekapitulere epitelendringene under IBD4. De fleste cellelinjer som brukes til å studere IBD er transformert, har evnen til å danne et monolag, og kan skille3, men forplantes egentlig annerledes enn ikke-transformerte tarmepitelceller i verten. Flere forskjellige murine modeller av betennelse brukes til å studere IBD, hvorav noen inkluderer knockout-modeller, smittsomme modeller, kjemiske inflammatoriske modeller og T-celleoverføringsmodeller 5,6,7,8. Mens hver kan studere visse etiologiske aspekter ved IBD, som genetiske predisposisjoner, barriere dysfunksjon, immunderegulering og mikrobiomet, er de begrenset i deres evne til å studere sykdommens multifaktorielle natur.
Intestinale organoider, inkludert enteroider og kolonoider, har blitt etablert i løpet av det siste tiåret som en nyttig in vitro-modell for å studere ikke bare dynamikken til intestinale stamceller, men også deres rolle, barrieren, integriteten og funksjonen til tarmepitelet spiller i intestinal homeostase og sykdom. Disse enhetene har bidratt betydelig til vår forståelse av patogenesen av IBD9 og har åpnet nye muligheter for personlig medisin. Kolonoider, eller stamcelleavledede, selvorganiserende vevskulturer fra tykktarmen, er utviklet fra både murine og humant vev i en prosess som gjør at stamceller lokalisert i tarmkrypter kan forplante seg og opprettholdes på ubestemt tid10. Stamcellenisjen in vivo er avhengig av ekstracellulære faktorer for å støtte veksten, spesielt den kanoniske Wnt-signaleringen og beinmorfogene proteinsignalveier11. Tilsetningen av disse faktorene fremmer helsen og levetiden til kolonoider, men driver også kulturen mot en stamcellelignende tilstand som ikke reflekterer in vivo epitelial cellulær arkitektur, som består av både selvfornyende og terminalt differensierte celler12,13. Mens funksjonaliteten til tarmepitelet er avhengig av den kontinuerlige crosstalken mellom stamcellerommet og differensierte celler, er evnen til å ha begge i et kolonoidkultursystem ganske begrenset. Til tross for disse begrensningene forblir det organoide kultursystemet gullstandarden for å studere epitelets inneboende egenskaper ex vivo. Likevel kan alternative kulturstrategier måtte vurderes for å svare på det vitenskapelige spørsmålet.
Det er vist at mus på et kontinuerlig 7-dagers regime med dekstrannatriumsulfat (DSS) utvikler både epitelinflammasjon og barrieredysfunksjon14. Videre har mitokondriell biogenesesvikt og metabolsk omprogrammering i tarmepitelet, som har vist seg å være tydelig i human IBD, også blitt fanget opp i denne DSS-modellen av kolitt15. Våre foreløpige data viser imidlertid at karakteristika ved mitokondriell biogenesesvikt ikke beholdes i kolonoider avledet fra kryptene til DSS-behandlede dyr (tilleggsfigur 1). Alternative dyrkningsmetoder må derfor brukes når man undersøker hvordan inflammasjon driver epitelforandringer under murine tarmbetennelse. Her skisserer vi en protokoll vi har utviklet som beskriver 1) hvordan man isolerer krypter fra hele kolonvev for etablering av murine kolonoider, 2) hvordan man terminalt differensierer denne cellepopulasjonen for å gjenspeile cellepopulasjonen som den står in vivo, og 3) hvordan man induserer betennelse i denne in vitro-modellen . For å studere legemiddelinteraksjoner i det betente epitelet, har vi utviklet en protokoll for å etablere 2-dimensonale (2D) monolayers fra murine colonoids som kan behandles basalt med inflammatoriske mediatorer og apikalt behandles med medikamentelle terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoidutvikling har revolusjonert måten det vitenskapelige samfunnet studerer organsystemer in vitro med evnen til delvis å rekapitulere cellulær struktur og funksjon fra et dyr eller menneske i en tallerken. Videre tilbyr organoide systemer avledet fra mennesker med sykdommer et lovende verktøy for personlig medisin som kan veilede terapeutisk beslutningstaking. Her beskriver vi en kryptisolasjonsprotokoll som fungerer bra og introduserer viktige trinn som gjør det mulig å rydde opp overflødig rusk i i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01DK120986 (til KPM).
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
- Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
- Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
- Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
- Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
- Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
- Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
- Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
- Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
- Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
- Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
- Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).
