Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos
Summary
Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.
Abstract
O epitélio intestinal desempenha um papel essencial na saúde humana, fornecendo uma barreira entre o hospedeiro e o meio externo. Esta camada celular altamente dinâmica fornece a primeira linha de defesa entre as populações microbiana e imune e ajuda a modular a resposta imune intestinal. A ruptura da barreira epitelial é uma característica da doença inflamatória intestinal (DII) e é de interesse para direcionamento terapêutico. O sistema de cultura colonóide tridimensional é um modelo in vitro extremamente útil para o estudo da dinâmica das células-tronco intestinais e da fisiologia das células epiteliais na patogênese das DII. Idealmente, o estabelecimento de colonoides a partir do tecido epitelial inflamado de animais seria mais benéfico na avaliação das influências genéticas e moleculares na doença. No entanto, mostramos que alterações epiteliais in vivo não são necessariamente retidas em colonoides estabelecidos em camundongos com inflamação aguda. Para abordar essa limitação, desenvolvemos um protocolo para tratar colonoides com um coquetel de mediadores inflamatórios que são tipicamente elevados durante a DII. Embora este sistema possa ser aplicado de forma ubíqua a várias condições de cultura, este protocolo enfatiza o tratamento tanto em colonóides diferenciados quanto em monocamadas bidimensionais derivadas de colonoides estabelecidos. Em um ambiente de cultura tradicional, os colonoides são enriquecidos com células-tronco intestinais, proporcionando um ambiente ideal para estudar o nicho de células-tronco. No entanto, esse sistema não permite uma análise das características da fisiologia intestinal, como a função de barreira. Além disso, os colonoides tradicionais não oferecem a oportunidade de estudar a resposta celular de células epiteliais terminalmente diferenciadas a estímulos pró-inflamatórios. Os métodos aqui apresentados fornecem uma estrutura experimental alternativa para abordar essas limitações. O sistema de cultura monocamada bidimensional 2-dimensional também oferece uma oportunidade para triagem terapêutica ex vivo. Esta camada polarizada de células pode ser tratada com mediadores inflamatórios na face basal da célula e concomitantemente com terapêutica putativa apicamente para determinar sua utilidade no tratamento da DII.
Introduction
A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica, remitente, recidivante, caracterizada por episódios de inflamação e quiescência clínica. A etiologia das DII é multifatorial, mas as principais características da doença incluem função de barreira defeituosa e aumento da permeabilidade do epitélio intestinal, além de cascatas de sinalização pró-inflamatórias ativadas dentro do compartimentoepitelial1,2. Vários modelos in vitro e in vivo têm sido utilizados para recapitular a resposta epitelial durante a DII, incluindo cultura celular e modelos murinos deinflamação3. No entanto, todos esses sistemas apresentam deficiências importantes que limitam sua capacidade de recapitular as alterações epiteliais durante aDII4. A maioria das linhagens celulares usadas para estudar a DII são transformadas, têm a capacidade de formar uma monocamada e podem diferenciar3, mas intrinsecamente se propagam de forma diferente das células epiteliais intestinais não transformadas no hospedeiro. Vários modelos murinos de inflamação são usados para estudar DII, alguns dos quais incluem modelos knockout, modelos infecciosos, modelos inflamatórios químicos e modelos de transferência de células T 5,6,7,8. Embora cada um possa estudar certos aspectos etiológicos da DII, como predisposições genéticas, disfunção de barreira, desregulação imunológica e microbioma, eles são limitados em sua capacidade de estudar a natureza multifatorial da doença.
Os organoides intestinais, incluindo enteróides e colonoides, têm se estabelecido na última década como um modelo in vitro útil para estudar não apenas a dinâmica das células-tronco intestinais, mas também seu papel que a integridade da barreira e a função do epitélio intestinal desempenham na homeostase e doença intestinal. Essas entidades têm contribuído significativamente para o nosso entendimento da patogênese da DII9 e têm aberto novas oportunidades para a medicina personalizada. Colonoides, ou culturas de tecidos auto-organizáveis derivados de células-tronco do cólon, têm sido desenvolvidos a partir de tecido murino e humano, em um processo que permite que células-tronco localizadas dentro de criptas intestinais se propaguem e sejam mantidas indefinidamente10. O nicho de células-tronco in vivo depende de fatores extracelulares para suportar seu crescimento, notadamente as vias canônicas de sinalização Wnt e osteomorfogênicas11. A adição desses fatores promove a saúde e a longevidade dos colonoides, mas também direciona a cultura para um estado semelhante ao das células-tronco que não reflete a arquitetura celular epitelial in vivo, que consiste tanto em células auto-renovadoras quanto terminalmente diferenciadas12,13. Enquanto a funcionalidade do epitélio intestinal é dependente do crosstalk contínuo entre o compartimento de células-tronco e células diferenciadas, a capacidade de ter ambos em um sistema de cultura colonóide é bastante limitada. Apesar dessas limitações, o sistema de cultura organoide continua sendo o padrão-ouro para o estudo das propriedades intrínsecas do epitélio ex vivo. No entanto, estratégias alternativas de cultura podem precisar ser consideradas para responder à questão científica em questão.
Foi demonstrado que camundongos em um regime contínuo de 7 dias de sulfato de sódio de dextran (DSS) desenvolvem inflamação epitelial e disfunção de barreira14. Além disso, a falha na biogênese mitocondrial e a reprogramação metabólica dentro do epitélio intestinal, que têm se mostrado evidentes na DII humana, também foram capturadas neste modelo de colite por DSS15. No entanto, nossos dados preliminares demonstram que as características de falha da biogênese mitocondrial não são retidas em colonoides derivados das criptas de animais tratados com DSS (Figura 1 Suplementar). Assim, métodos alternativos de cultura devem ser usados ao examinar como a inflamação conduz alterações epiteliais durante a inflamação intestinal murina. Aqui, delineamos um protocolo que desenvolvemos que descreve 1) como isolar criptas de todo o tecido colônico para o estabelecimento de colonoides murinos, 2) como diferenciar terminalmente essa população celular para refletir a população celular como ela está in vivo, e 3) como induzir inflamação neste modelo in vitro . Para estudar as interações medicamentosas dentro do epitélio inflamado, desenvolvemos um protocolo para estabelecer monocamadas 2-dimensonais (2D) de colonoides murinos que podem ser tratadas basalmente com mediadores inflamatórios e tratadas apicamente com terapias medicamentosas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento de organoides revolucionou a forma como a comunidade científica estuda sistemas orgânicos in vitro com a capacidade de recapitular parcialmente a estrutura e a função celular de um animal ou humano em um prato. Além disso, sistemas organoides derivados de humanos com doenças oferecem uma ferramenta promissora para a medicina personalizada que pode orientar a tomada de decisões terapêuticas. Aqui, descrevemos um protocolo de isolamento de cripta que funciona bem e introduz etapas importa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants R01DK120986 (para K.P.M.).
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Riferimenti
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