Summary
本协议描述了一种使用全细胞膜片钳技术实时和动态采集H9c2心肌细胞中的电压门控钾(Kv)通道电流的有效方法。
Abstract
心肌细胞膜上的钾通道在调节细胞电生理活动中起重要作用。作为主要的离子通道之一,电压门控钾(Kv)通道与一些严重的心脏病密切相关,例如药物引起的心肌损伤和心肌梗塞。本研究采用全细胞膜片钳技术测定1.5 mM 4-氨基吡啶(4-AP,一种广谱钾通道抑制剂)和乌头碱(AC,25 μM、50 μM、100 μM 和 200 μM)对 H9c2 心肌细胞中 Kv 通道电流 (IKv) 的影响。结果表明,4-AP抑制I Kv约54%,而AC对IKv的抑制作用呈剂量依赖趋势(25 μM无影响,50 μM抑制率为30%,100 μM抑制率为46%,200 μM抑制率为54%)。由于具有较高的灵敏度和精密度的特点,该技术将促进民族医学靶向离子通道的心脏毒性和药理作用的探索。
Introduction
离子通道是嵌入细胞膜脂质双层的特殊整合蛋白。在活化剂存在下,这种特殊整合蛋白的中心形成高度选择性的亲水孔,允许适当大小和电荷的离子以被动运输方式通过1。离子通道是细胞兴奋性和生物电的基础,在各种细胞活动中起着关键作用2。心脏通过由动作电位启动的激发-收缩耦合过程引起的规律收缩向其他器官供血3.已有研究证实,心肌细胞动作电位的产生是由细胞内离子浓度的变化引起的,人心肌细胞中Na+、Ca2+和K+离子通道的活化和失活导致动作电位按一定序列4,5,6形成。电压门控钾(Kv)通道电流(IKv)紊乱可能会改变正常的心律,导致心律失常,这是导致死亡的主要原因之一。因此,记录IKv对于了解治疗危及生命的心律失常的药物机制至关重要7。
Kv通道是钾通道的重要组成部分。Kv通道的协调功能在哺乳动物心脏的电活动和心肌收缩力中起重要作用8,9,10。在心肌细胞中,动作电位的幅度和持续时间取决于多个 Kv 通道亚型向外 K+ 电流的共同传导11。Kv通道功能的调节对于心脏动作电位的正常复极化非常重要。即使是Kv电导的最轻微变化也会极大地影响心脏复极化并增加心律失常的可能性12,13。
代表细胞电生理研究的基本方法,可以通过施加负压在细胞膜的小区域和用于全细胞膜片钳记录的移液器吸头之间建立高电阻密封。持续的负压使细胞膜与移液器吸头接触并粘在移液器的内壁上。由此产生的完整电路允许人们记录穿过细胞膜14表面的任何单个离子通道电流。该技术对细胞膜离子通道电流具有非常高的灵敏度,可用于检测所有离子通道中的电流,应用极其广泛15。此外,与荧光标记和放射性标记相比,膜片钳具有更高的权威性和准确性16。目前,全细胞膜片钳技术已被用于检测作用于Kv通道电流17,18,19的中药成分。例如,Wang等人使用全细胞膜片钳技术,证实莲子的有效成分可能通过阻断活化状态通道19来实现对Kv4.3通道的抑制。乌头碱(AC)是乌头属的有效活性成分之一,如乌头和乌头摆布希。大量研究表明,过量服用AC会导致心律失常甚至心脏骤停20。AC和电压门控离子通道之间的相互作用导致细胞内离子稳态的破坏,这是心脏毒性的关键机制21。因此,本研究采用全细胞膜片钳技术测定AC对心肌细胞IKv的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
将商业获得的H9c2大鼠心肌细胞(见 材料表)在含有10%热灭活胎牛血清(FBS)和1%青霉素 - 链霉素的DMEM中在37°C的5%CO2加湿气氛中孵育。然后采用全细胞膜片钳技术检测正常H9c2细胞和4-AP或AC处理细胞中IKv 的变化(图1 和 图2)。
1. 溶液制备
- 制备含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM细胞培养基(见 材料表)。
- 通过将 14.1165 mg 4-AP 添加到 100 μL DMSO 溶液中来制备 1.5 M 4-AP 溶液(参见 材料表)。通过加入细胞外溶液将1.5M 4-AP稀释至1.5mM(步骤1.5)。
- 通过将 5 mg AC 加入 19.36 μL DMSO 溶液中来制备 400 mM AC(参见 材料表)。
注意:上述所有溶液均储存在4°C冰箱中,DMSO的最终浓度不得超过0.1%(v / v)。 - 通过将 0.4100 g KCl (110.0 mM)、0.0120 g MgCl 2 (1.2 mM)、0.1270 g Na2 ATP (5.0 mM)、0.1190 g HEPES (10.0 mM) 和 0.1900 g EGTA (10.0 mM) 加入 50 mL 双蒸水中制备 50 mL 细胞内溶液(参见表 1 和材料表)。
注意:使用1M KOH将细胞内溶液的pH值调节至7.2,并等分成小体积(1.5-2mL)并储存在-20°C。 - 通过将 0.0185 g KCl (5.0 mM)、0.3945 g NaCl (135.0 mM)、0.0203 g MgCl 2·6H 2 O (2.0 mM)、0.0595 g HEPES (5.0 mM) 和 0.0990 g D-葡萄糖 (10.0 mM) 加入 50 mL 双蒸水中制备 50 mL 细胞外溶液(参见表 1 和 材料表)。
注意:细胞外溶液必须准备立即使用,并且需要使用1M NaOH将其pH值调节至7.4。
2. 细胞培养
- 一旦H9c2培养皿汇合80%,用0.25%胰蛋白酶消化细胞30秒。
- 用普通培养基或含药物培养基(25 μM、50 μM、100 μM 和 200 μM AC)在铺有玻璃板的 35 mm 培养皿中培养 2 x 105 细胞/mL,在 37 °C 下,5% CO2 气氛和 70% 至 80% 相对湿度(参见 材料表)。
3. 微量移液器的制造
- 打开微量移液器拉拔器(参见 材料表),并预热30分钟。
- 将带有细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管(外径:1.5毫米,内径:1.10毫米,长10厘米)放在微量移液器拉拔器上。选择在步骤 3.3 中设置的程序,然后单击控制面板上的 Enter 键。单击右上角的 斜坡 程序以确定玻璃毛细管的“热量”值。
- 根据“斜坡”测试确定的值编写拉电极的程序,并按照以下步骤:“热量”值=“斜坡”值,拉力=0,Vel=拉杆移动速度,时间=200-250。单击 拉 动开始制造移液器。
注意:使用前观察微量移液器拉拔器密封容器中干燥剂的颜色。如果颜色从蓝色变为粉红色,则必须更换干燥剂。为防止电极尖端污染,在移液器制备过程中尽量不要触摸玻璃毛细管的中间部分。随后,小心地取出产生的移液器,并将它们放入封闭密封的容器中。
4. 仪器设置
- 按以下顺序打开相应的仪器:数模转换器、信号放大器、显微操纵器、显微镜和相机(见 材料表)。
- 依次打开成像应用程序、信号放大器软件和数据采集软件(见 材料表)。
注意:仪器必须按顺序打开;否则,打开软件后将出现“演示数字化器”状态。
5. IKv 参数设置
- 按照以下步骤编辑记录IKv 的协议。
- 单击“编辑”,然后在数据采集软件中选择“编辑协议”(参见材料表)。
- 在“波形”界面中编辑程序:纪元 A(第一级 = −60 mV,三角洲电平 = 0 mV,第一持续时间 = 20 毫秒,增量持续时间 = 0 毫秒);大纪元 B(第一级 = −40 mV,增量电平 = 10 mV,第一持续时间 = 150 毫秒,增量持续时间 = 0 毫秒)和大纪元 C(第一级 = −60 mV,增量电平 = 0 mV,第一持续时间 = 30 毫秒,增量持续时间 = 0 毫秒)。
- 然后,单击 模式/速率 界面,并设置“试用层次结构”数据:试用延迟 = 0 秒,运行 = 1,扫描 = 11,扫描持续时间 = 0.22 秒22,23。
注意:在控制条件下,在−60 mV保持电位下施加150 mV去极化步进,在−60 mV保持电位下,以10 mV的增量,获取IKv 通道电流。协议的总时间需要大于“波形”程序中设置的时间。
- 编辑 P/N 泄漏减法程序:单击“编辑协议”以选择“激励”按钮,然后在“P/N 泄漏减法”对话框中设置泄漏减法程序:子扫描次数 = 2-8(本研究中为 4),建立时间 = 100-1,000 ms(本研究中为 200),“极性”=“与波形相反”,保持电平 = −80 mV。
注意:P/N泄漏减法的保持电平必须低于“首次保持”(−60 mV)。
6. 电压钳模式下I Kv 的全电池膜片钳记录
- 建立数据存储路径:点击文件,在数据采集软件中选择设置数据文件名。通过选择编辑并单击数据采集软件中的开放协议,打开已建立的IKv协议(步骤5.1)。最后,单击“工具”选项,然后选择“膜测试”以开始运行协议。
- 将细胞外溶液(步骤1.5)加入全细胞膜片钳装置上的细胞浴中(参见 材料表),并将盖玻片向上放置,将H9c2细胞(在步骤2.1中培养)置于浴中。
- 用细胞外溶液填充30%的移液器(在步骤3中制造),并将其安装在集成到膜片钳装置中的记录电极支架上。用O形圈橡胶垫圈和塑料垫圈拧紧移液器。然后,用显微操纵器将移液器放入浴中。单击信号放大器软件的 移液器偏移 接口(参见 材料表),将IKv 电流基线保持在0 pA。
注意:细胞内溶液(步骤1.4)必须与银丝的AgCl / Ag部分接触,并且银线不得靠近移液器的内壁。移液器的电阻需要为2-6 MΩ。为避免移液器吸头被堵塞,必须使用通过塑料管24连接到记录电极支架的1.0 mL注射器将连续的正压输送到移液器。 - 使用通过塑料管连接到记录电极支架的 1.0 mL 注射器手动输送适当的正压。通过三维操作显微操纵器以接触细胞来稍微移动移液器。
- 一旦移液器接触细胞膜后膜测试方波下降1/3至1/2,去除正压,并手动提供适当的负压。然后,点击数据采集软件的补丁界面,形成GΩ密封。在电池密封过程中使用“C p Fast”和“Cp Slow”信号放大器软件来补偿快速和慢速电容。
注意:当膜测试为≥1 GΩ时,移液器吸头和细胞之间形成细胞连接配置。 - 施加短暂的负压脉冲以破坏细胞膜的贴片。
注意:膜电阻的急剧降低是成功的全细胞记录模式的特征。如果接入电阻(Ra)≥30 MΩ,则必须在步骤6.3-6.6中重新选择电池。为了保证记录的IKv 数据的准确性,必须在细胞膜破裂后去除负压。 - 通过单击信号放大器软件的全电池按钮执行 全电池 膜电容补偿。最后,通过单击保存并记录数据 数据记录 按钮。
- 使用数据分析软件打开保存的IKv 数据。保存电流-电压 (I−V) 关系:单击“ 分析 ”以选择 “统计 ”以执行以下操作:选择 范围 作为 Cousors 1,2 进行数据分析;单击“ 峰值幅度 ”和 “平均值 ”按钮,然后单击“ 确定 ”以查看 “结果 ”页面中的数据。最后,将IKv 均值数据的列复制到功能绘图软件中(见 材料表)进行进一步分析。
- 保存代表性的IKv电流迹线:单击“编辑”以选择“传输迹线”;然后,在“要传输的区域”中选择“完整跟踪”;接下来,点击 选择 在 迹线选择,然后选择 IN 0 (pA) in 信号;最后,点击确定查看“结果”页面中的数据,并将总数据复制到功能绘图软件中绘制当前迹线。
- 保存 IKv 协议:单击“编辑”以选择“创建激励波形信号”,然后选择“确定”。然后,重做步骤6.9,除了在“信号”中选择A0#0(mA)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议允许根据全细胞膜片钳技术中设置的参数记录IKv。IKv 由 −40 至 +60 mV 的 150 ms 去极化脉冲激励触发,保持电位为 −60 mV(图 3A)。H9c2大鼠心肌细胞的IKv首先出现在-20 mV左右,然后随着进一步去极化而振幅增加。根据测得的电流幅度计算IKv与膜电位之间的平均关系。结果表明,与对照组相比,用1.5 mM 4-AP处理5 min后,IKv振幅明显降低(图3B)。此外,在24小时AC处理后,IKv在膜电位从10mV到60mV以剂量依赖性方式显着降低(图3C-F)。
图 1:记录 IKv 所需的设备和仪器。请单击此处查看此图的大图。
图2:使用全细胞膜片钳技术在H9c2细胞中电生理记录IKv的流程图。 (A)细胞培养。(B)细胞内和细胞外溶液的制备。(C)全细胞记录示意图。C1:将移液器靠近细胞;C2:在移液器和细胞之间形成高电阻密封;C3:细胞膜破裂。(d) 记录 IKv.D1:K+电流形成示意图;D2:在全电池电压钳位模式下记录的IKv的代表性电流迹线。请点击此处查看此图的大图。
图 3:H9c2 细胞中的代表性 IKv。(A) 在没有任何处理的 H9c2 细胞中测量的 IKv 的代表性电流迹线(对照组),用含 AC 的培养基 24 小时(25 μM、50 μM、100 μM 和 200 μM),用 1.5 mM 4-AP 持续 5 分钟。IKv由−40至+60 mV的150 ms去极化脉冲触发,保持电位为−60 mV。(B)对于1.5 mM 4-AP刺激,IKv在膜电位下从10 mV下降到60 mV。(C-F)AC处理在膜电位从10 mV到60 mV时以浓度依赖性方式降低IKv。*p < 0.05 与对照组 (n = 6)。请点击此处查看此图的大图。
细胞外溶液 | ||
化学药品 | 克/50毫升 | 成分(毫米) |
氯化钠 | 0.3945 | 135.0 |
氯化钾 | 0.1865 | 5.0 |
赫佩斯 | 0.5958 | 5.0 |
氯化镁 2·6H2O | 0.2033 | 2.0 |
D-葡萄糖 | 0.9900 | 10.0 |
细胞内溶液 | ||
化学药品 | 克/50毫升 | 成分(毫米) |
氯化钾 | 0.4100 | 110.0 |
氯化镁2 | 0.0120 | 1.2 |
2-丁二胺酸钠 | 0.1270 | 5.0 |
赫佩斯 | 0.1190 | 10.0 |
埃格塔 | 0.1900 | 10.0 |
表1:用于在电压钳位模式下记录IKv 的细胞内和细胞外溶液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
膜片钳电生理技术主要用于记录和反映细胞膜25上离子通道的电活动和功能特性。目前,膜片钳技术的主要记录方法包括单通道记录和全细胞记录26。对于全细胞模式,玻璃微电极和负压用于在细胞膜的小面积和移液器吸头27之间形成高电阻密封。一旦持续的负压导致移液器的尖端破裂细胞膜并且膜附着在移液器的内壁上,移液器和细胞之间形成的完整电路允许记录细胞膜表面上各个离子通道的电流密度26,27.近年来,全细胞膜片钳技术已广泛应用于靶向离子通道相关疾病的药物研究。尽管对操作人员的要求很高,但该技术仍然是离子通道研究的“黄金标准”28。此外,穿孔膜片钳技术还可以通过使用抗生素在细胞膜29,30中形成通透性孔来记录相对稳定的细胞内环境中靶离子通道的电流变化。在电流钳或电压钳模式下,可以使用全细胞膜片钳技术记录和追踪离子通道电压或电流的动态变化,这无疑是评估药物药理活性或毒性机制的强大平台31,32。
AC是乌头属的主要毒性成分之一,属于二酯-二萜类生物碱组,有剧毒20,33。有证据表明AC可引起心血管毒性34,35。作为一种非选择性K+通道阻断剂,已有报道交流可阻断瞬态向外K+电流、超快速延迟整流器K+电流和快速延迟整流器向外K+电流,诱发心律失常21、36、37。迄今为止,没有强有力的证据表明电压依赖性钾电流与交流电的心脏毒性有关。因此,本研究采用全细胞膜片钳技术检查AC对大鼠H9c2心肌细胞IKv的抑制作用。Na+通道的激活是AC发挥药理学或毒理学作用的一种广泛认可的机制38。有趣的是,有证据表明AC可以直接作用于IKv21,36,37。然而,本文提供的数据并未提供足够的证据证明AC可以直接抑制IKv。AC的IKv抑制作用可能是由于Na+通道的直接激活,这需要进一步研究。
本研究中使用的全细胞膜片钳技术自诞生和发展以来,已成为从离子通道方面探索药物心脏毒性的常规方法。本实验证实,AC在电压钳位模式下以浓度依赖性方式有效抑制H9c2电池的IKv。然而,每种类型的离子通道,包括K +通道,都包含几种亚型,并且本研究中仅记录了总电压依赖性K +通道电流。随后的研究可以通过具有高表达特定离子通道亚型的模型细胞系37来探索AC的药理学和毒理学机制。或者,可以结合用荧光蛋白标记的特定离子通道,以目视研究AC的心肌毒性39。该协议中的关键步骤是步骤6.4-6.6;完成这三个步骤直接决定了后续的IKv录制是否成功。与其他技术相比,全细胞膜片钳技术是记录细胞膜或细胞器膜中单离子通道电流的金标准和公认的方法,具有技术要求高、通量低记录的特点40.综上所述,该技术不仅是细胞电生理学研究的基本方法,而且在神经科学、心血管科学等领域也得到了广泛的应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
感谢国家自然科学基金(82130113)和青海省科技厅重点研发转化计划(2020-SF-C33)的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
- Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
- Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
- Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L.
Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010). - Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
- Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
- Grant, A. O.
Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009). - Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
- Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
- Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
- Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
- Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
- Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
- Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
- Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
- Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
- Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
- Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
- Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
- An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
- Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
- Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
- Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
- Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
- Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
- Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
- Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
- Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
- Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
- Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
- Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
- Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
- Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
- Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
- Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
- Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).