اختبار الكفاءة في المختبر وفي الجسم الحي للجسيمات النانوية mRNA-Lipid التي تمت صياغتها عن طريق خلط الموائع الدقيقة
Summary
هنا ، يتم تقديم بروتوكول لصياغة الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) التي تغلف mRNA الذي يشفر لوسيفيراز اليراعات. تم اختبار هذه LNPs لفعاليتها في المختبر في خلايا HepG2 وفي الجسم الحي في الفئران C57BL / 6.
Abstract
جذبت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) اهتماما واسع النطاق مؤخرا مع التطوير الناجح للقاحات COVID-19 mRNA بواسطة Moderna و Pfizer / BioNTech. أثبتت هذه اللقاحات فعالية علاجات mRNA-LNP وفتحت الباب أمام التطبيقات السريرية المستقبلية. في أنظمة mRNA-LNP ، تعمل LNPs كمنصات توصيل تحمي شحنة mRNA من التدهور بواسطة النيوكليازات وتتوسط في توصيلها داخل الخلايا. تتكون LNPs عادة من أربعة مكونات: الدهون المؤينة ، والفوسفوليبيد ، والكوليسترول ، واقتران البولي إيثيلين جلايكول (PEG) المرتبط بالدهون (lipid-PEG). هنا ، يتم صياغة LNPs التي تغلف mRNA بتشفير لوسيفيراز اليراع عن طريق خلط الموائع الدقيقة للمرحلة العضوية التي تحتوي على مكونات الدهون LNP والمرحلة المائية التي تحتوي على mRNA. ثم يتم اختبار mRNA-LNPs في المختبر لتقييم كفاءة نقلها في خلايا HepG2 باستخدام مقايسة قائمة على لوحة التوهج الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم mRNA-LNPs في الجسم الحي في الفئران C57BL / 6 بعد الحقن في الوريد عبر الوريد الجانبي الذيل. يتم إجراء تصوير التلألؤ الحيوي لكامل الجسم باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي . تم عرض النتائج التمثيلية لخصائص mRNA-LNP ، وكفاءة نقلها في خلايا HepG2 ، والتدفق الكلي للإنارة في الفئران C57BL / 6.
Introduction
أظهرت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) وعدا كبيرا في السنوات الأخيرة في مجال العلاج الجيني غير الفيروسي. في عام 2018 ، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على أول علاج على الإطلاق لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، Onpattro by Alnylam ، لعلاج الداء النشواني الوراثي transthyretin1،2،3،4. كانت هذه خطوة مهمة إلى الأمام للجسيمات النانوية الدهنية والعلاجات القائمة على الحمض النووي الريبي. في الآونة الأخيرة ، حصلت Moderna و Pfizer / BioNTech على موافقات إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على لقاحات mRNA-LNP ضد SARS-CoV-2 4,5. في كل من علاجات الحمض النووي القائمة على LNP ، يعمل LNP على حماية حمولته من التدهور بواسطة النيوكليازات وتسهيل التوصيل القوي داخل الخلايا 6,7. بينما شهدت LNPs نجاحا في علاجات RNAi وتطبيقات اللقاح ، تم أيضا استكشاف mRNA-LNPs لاستخدامها في العلاجات البديلة للبروتين8 وكذلك للتوصيل المشترك ل Cas9 mRNA وتوجيه الحمض النووي الريبي لتسليم نظام CRISPR-Cas9 لتحرير الجينات9. ومع ذلك ، لا توجد تركيبة واحدة محددة مناسبة تماما لجميع التطبيقات ، ويمكن أن تؤثر التغييرات الطفيفة في معلمات صياغة LNP بشكل كبير على الفاعلية والتوزيع الحيوي في الجسم الحي8،10،11. وبالتالي ، يجب تطوير وتقييم mRNA-LNPs الفردية لتحديد الصيغة المثلى لكل علاج قائم على LNP.
عادة ما يتم صياغة LNPs بأربعة مكونات دهنية: الدهون المؤينة ، والفوسفوليبيد ، والكوليسترول ، ومترافق البولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEG) المرتبط بالدهون (Lipid-PEG) 11،12،13. يعتمد التوصيل القوي داخل الخلايا الذي تسهله LNPs ، جزئيا ، على مكون الدهون المؤين12. هذا المكون محايد عند درجة الحموضة الفسيولوجية ولكنه يصبح مشحونا إيجابيا في البيئة الحمضية للإندوسوم11. يعتقد أن هذا التغيير في الشحنة الأيونية هو مساهم رئيسي في الهروب الداخلي12،14،15. بالإضافة إلى الدهون المؤينة ، يعمل مكون الفوسفوليبيد (الدهون المساعدة) على تحسين تغليف الشحنة ويساعد في الهروب الداخلي ، ويوفر الكوليسترول الاستقرار ويعزز اندماج الغشاء ، ويقلل الدهون-PEG من تراكم LNP و opsonization في الدورةالدموية 10،11،14،16. لصياغة LNP ، يتم دمج مكونات الدهون هذه في طور عضوي ، عادة الإيثانول ، ويتم خلطها مع مرحلة مائية تحتوي على شحنة الحمض النووي. عملية صياغة LNP متعددة الاستخدامات للغاية من حيث أنها تسمح باستبدال المكونات المختلفة بسهولة ودمجها بنسب مولية مختلفة من أجل صياغة العديد من تركيبات LNP مع العديد من الخصائص الفيزيائية والكيميائية10,17. ومع ذلك ، عند استكشاف هذا التنوع الكبير من LNPs ، من الأهمية بمكان تقييم كل صيغة باستخدام إجراء موحد لقياس الاختلافات في التوصيف والأداء بدقة.
هنا ، يتم تحديد سير العمل الكامل لصياغة mRNA-LNPs وتقييم أدائها في الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام سير العمل هذا ، يمكن صياغة مجموعة متنوعة من mRNA-LNPs واختبارها من حيث كفاءتها في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن تبديل الدهون والسواغات المؤينة ودمجها بنسب مولية مختلفة ونسب مختلفة من الدهون المؤينة إلى mRNA لإنتاج mRNA-LNPs بخصائص فيزيائية كيميائية مختلفة22. هنا ، قمنا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف M.J.M. بالدعم المقدم من جائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) (DP2 TR002776) ، وجائزة Burroughs Wellcome Fund Career في الواجهة العلمية (CASI) ، وجائزة CAREER لمؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية (CBET-2145491) ، وتمويل إضافي من المعاهد الوطنية للصحة (NCI R01 CA241661 و NCI R37 CA244911 و NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
Riferimenti
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
