בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי
Summary
כאן מוצג פרוטוקול לניסוח ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) המכילים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית. LNPs אלה נבדקו על עוצמתם במבחנה בתאי HepG2 ו-in vivo בעכברי C57BL/6.
Abstract
ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) משכו תשומת לב נרחבת לאחרונה עם הפיתוח המוצלח של חיסוני mRNA לקורונה על ידי מודרנה ופייזר/ביונטק. חיסונים אלה הוכיחו את יעילותם של טיפולי mRNA-LNP ופתחו את הדלת ליישומים קליניים עתידיים. במערכות mRNA-LNP, ה-LNPs משמשים כפלטפורמות שיגור המגנות על מטען ה-mRNA מפני התפרקות על ידי נוקלאזות ומתווכות את האספקה התוך-תאית שלהם. LNPs מורכבים בדרך כלל מארבעה מרכיבים: ליפיד מיונן, פוספוליפיד, כולסטרול, ופוליאתילן גליקול מעוגן שומנים (PEG) מצומד (ליפיד PEG). כאן, LNPs העוטפים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית מנוסחים על ידי ערבוב מיקרופלואיד של השלב האורגני המכיל רכיבי שומנים LNP והפאזה המימית המכילה mRNA. mRNA-LNPs אלה נבדקים לאחר מכן במבחנה כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה שלהם בתאי HepG2 באמצעות בדיקה מבוססת לוחות ביולומינסנטיים. בנוסף, mRNA-LNPs מוערכים in vivo בעכברי C57BL/6 לאחר הזרקה תוך ורידית דרך וריד הזנב הצידי. דימות ביולומינסנציה של כל הגוף מתבצע באמצעות מערכת הדמיה in vivo . תוצאות מייצגות מוצגות עבור מאפייני mRNA-LNP, יעילות הטרנספקציה שלהם בתאי HepG2 ושטף האור הכולל בעכברי C57BL/6.
Introduction
ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) הוכיחו הבטחה גדולה בשנים האחרונות בתחום הטיפול הגנטי שאינו ויראלי. בשנת 2018, מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר את הטיפול הראשון אי פעם בהפרעות RNA (RNAi), Onpattro by Alnylam, לטיפול בעמילואידוזיס טרנסתירטין תורשתי 1,2,3,4. זה היה צעד חשוב קדימה עבור ננו-חלקיקי שומנים וטיפולים מבוססי RNA. לאחרונה, מודרנה ופייזר/ביונטק קיבלו אישורי FDA לחיסוני mRNA-LNP שלהם נגד SARS-CoV-2 4,5. בכל אחד מטיפולי חומצות הגרעין מבוססי LNP, LNP משמש להגנה על המטען שלו מפני פירוק על ידי נוקלאזות ולהקל על משלוח תוך-תאי חזק 6,7. בעוד LNPs ראו הצלחה בטיפולי RNAi ויישומי חיסונים, mRNA-LNPs נחקרו גם לשימוש בטיפולים תחליפי חלבונים8, כמו גם להעברה משותפת של Cas9 mRNA ומנחה RNA להעברת מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים9. עם זאת, אין נוסחה ספציפית אחת המתאימה היטב לכל היישומים, ושינויים עדינים בפרמטרים של נוסחת LNP יכולים להשפיע מאוד על העוצמה וההפצה הביולוגית in vivo 8,10,11. לפיכך, יש לפתח ולהעריך mRNA-LNPs בודדים כדי לקבוע את הנוסחה האופטימלית עבור כל טיפול מבוסס LNP.
LNPs מנוסחים בדרך כלל עם ארבעה רכיבי שומנים: ליפיד מיונן, פוספוליפיד, כולסטרול ופוליאתילן-גליקול מעוגן שומנים (PEG) מצומד (ליפיד PEG)11,12,13. ההעברה התוך-תאית רבת העוצמה המתאפשרת על ידי LNPs מסתמכת, בחלקה, על רכיב השומנים המיוננים12. מרכיב זה הוא נייטרלי ב- pH פיזיולוגי אך הופך להיות טעון חיובי בסביבה החומצית של אנדוזום11. שינוי זה במטען היוני נחשב כתורם מרכזי לבריחה אנדוזומלית12,14,15. בנוסף לשומנים המיוננים, מרכיב הפוספוליפידים (ליפיד עוזר) משפר את האנקפסולציה של המטען ומסייע בבריחה אנדוזומלית, הכולסטרול מציע יציבות ומשפר את איחוי הממברנה, והליפידים-PEG ממזער צבירה ואופסוניזציה של LNP במחזורהדם 10,11,14,16. כדי לגבש את LNP, רכיבי שומנים אלה משולבים בפאזה אורגנית, בדרך כלל אתנול, ומעורבבים עם פאזה מימית המכילה את מטען חומצת הגרעין. תהליך ניסוח LNP הוא מאוד תכליתי בכך שהוא מאפשר להחליף בקלות רכיבים שונים ולשלב אותם ביחסים מולאריים שונים על מנת לגבש נוסחאות LNP רבות עם שפע של תכונות פיסיקוכימיות10,17. עם זאת, כאשר בוחנים מגוון עצום זה של LNPs, חיוני שכל ניסוח יוערך באמצעות הליך סטנדרטי כדי למדוד במדויק את ההבדלים באפיון ובביצועים.
כאן, זרימת העבודה המלאה עבור ניסוח של mRNA-LNPs ואת הערכת הביצועים שלהם בתאים ובבעלי חיים מתואר.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות תהליך עבודה זה, ניתן לגבש ולבדוק מגוון של mRNA-LNPs עבור יעילות in vitro ו– in vivo שלהם. ניתן להחליף ולשלב ליפידים וחומרים פעילים מיוננים ביחסים מולאריים שונים וביחסי משקל שונים בין ליפידים מיוננים ל-mRNA כדי לייצר mRNA-LNPs בעלי תכונות פיסיקוכימיות שונות22. כאן, יצרנו C12-200 mRNA-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. מודה על תמיכתו של מנהל המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב (NIH) פרס החדשן החדש (DP2 TR002776), פרס הקריירה של קרן Burroughs Wellcome בממשק המדעי (CASI), פרס CAREER של הקרן הלאומית למדע של ארה”ב (CBET-2145491), ומימון נוסף מהמכונים הלאומיים לבריאות (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ו- NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
Riferimenti
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
