Test dell'efficienza in vitro e in vivo di nanoparticelle mRNA-lipidi formulate mediante miscelazione microfluidica
Summary
Qui viene presentato un protocollo per la formulazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) che incapsulano l’mRNA che codifica per la luciferasi delle lucciole. Questi LNP sono stati testati per la loro potenza in vitro in cellule HepG2 e in vivo in topi C57BL/6.
Abstract
Le nanoparticelle lipidiche (LNP) hanno recentemente attirato l’attenzione generale con il successo dello sviluppo dei vaccini a mRNA COVID-19 di Moderna e Pfizer/BioNTech. Questi vaccini hanno dimostrato l’efficacia delle terapie a base di mRNA-LNP e hanno aperto la porta a future applicazioni cliniche. Nei sistemi mRNA-LNP, gli LNP fungono da piattaforme di rilascio che proteggono il carico di mRNA dalla degradazione da parte delle nucleasi e mediano il loro rilascio intracellulare. Le LNP sono tipicamente composte da quattro componenti: un lipide ionizzabile, un fosfolipide, il colesterolo e un coniugato di polietilenglicole (PEG) ancorato ai lipidi (lipid-PEG). Qui, gli LNP che incapsulano l’mRNA che codifica per la luciferasi della lucciola sono formulati mediante miscelazione microfluidica della fase organica contenente i componenti lipidici LNP e della fase acquosa contenente l’mRNA. Questi mRNA-LNP vengono quindi testati in vitro per valutare la loro efficienza di trasfezione nelle cellule HepG2 utilizzando un saggio bioluminescente basato su piastre. Inoltre, gli mRNA-LNP sono valutati in vivo in topi C57BL/6 a seguito di un’iniezione endovenosa attraverso la vena caudale laterale. L’imaging a bioluminescenza di tutto il corpo viene eseguito utilizzando un sistema di imaging in vivo . Vengono mostrati risultati rappresentativi per le caratteristiche dell’mRNA-LNP, la loro efficienza di trasfezione nelle cellule HepG2 e il flusso luminescente totale nei topi C57BL/6.
Introduction
Le nanoparticelle lipidiche (LNP) si sono dimostrate molto promettenti negli ultimi anni nel campo della terapia genica non virale. Nel 2018, la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato la prima terapia di interferenza dell’RNA (RNAi), Onpattro di Alnylam, per il trattamento dell’amiloidosi ereditaria da transtiretina 1,2,3,4. Questo è stato un importante passo avanti per le nanoparticelle lipidiche e le terapie a base di RNA. Più recentemente, Moderna e Pfizer/BioNTech hanno ricevuto l’approvazione della FDA per i loro vaccini mRNA-LNP contro SARS-CoV-2 4,5. In ciascuna di queste terapie a base di acidi nucleici a base di LNP, l’LNP serve a proteggere il suo carico dalla degradazione da parte delle nucleasi e a facilitare una potente veicolazione intracellulare 6,7. Mentre le LNP hanno avuto successo nelle terapie RNAi e nelle applicazioni dei vaccini, le mRNA-LNP sono state esplorate anche per l’uso nelle terapie di sostituzione proteica8 e per la co-somministrazione di mRNA Cas9 e RNA guida per la somministrazione del sistema CRISPR-Cas9 per l’editing genetico9. Tuttavia, non esiste una formulazione specifica adatta a tutte le applicazioni e sottili cambiamenti nei parametri di formulazione di LNP possono influenzare notevolmente la potenza e la biodistribuzione in vivo 8,10,11. Pertanto, i singoli mRNA-LNP devono essere sviluppati e valutati per determinare la formulazione ottimale per ciascuna terapia a base di LNP.
Le LNP sono comunemente formulate con quattro componenti lipidici: un lipide ionizzabile, un fosfolipide, il colesterolo e un coniugato polietilenglicole (PEG) ancorato ai lipidi (lipid-PEG)11,12,13. Il potente rilascio intracellulare facilitato dalle LNP si basa, in parte, sulla componente lipidica ionizzabile12. Questo componente è neutro a pH fisiologico ma si carica positivamente nell’ambiente acido dell’endosoma11. Si ritiene che questo cambiamento nella carica ionica sia un fattore chiave per la fuga endosomiale12,14,15. Oltre al lipide ionizzabile, la componente fosfolipidica (lipide helper) migliora l’incapsulamento del carico e aiuta nella fuga endosomiale, il colesterolo offre stabilità e migliora la fusione della membrana e il lipide-PEG riduce al minimo l’aggregazione e l’opsonizzazione di LNP in circolazione10,11,14,16. Per formulare l’LNP, questi componenti lipidici vengono combinati in una fase organica, tipicamente etanolo, e miscelati con una fase acquosa contenente il carico di acido nucleico. Il processo di formulazione di LNP è molto versatile in quanto consente di sostituire e combinare facilmente diversi componenti a diversi rapporti molari al fine di formulare molte formulazioni di LNP con una moltitudine di proprietà fisico-chimiche10,17. Tuttavia, quando si esplora questa vasta varietà di LNP, è fondamentale che ogni formulazione venga valutata utilizzando una procedura standardizzata per misurare con precisione le differenze nella caratterizzazione e nelle prestazioni.
Qui viene delineato il flusso di lavoro completo per la formulazione di mRNA-LNP e la valutazione delle loro prestazioni in cellule e animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con questo flusso di lavoro, una varietà di mRNA-LNP può essere formulata e testata per la loro efficienza in vitro e in vivo. I lipidi ionizzabili e gli eccipienti possono essere scambiati e combinati con diversi rapporti molari e diversi rapporti di peso tra lipidi ionizzabili e mRNA per produrre mRNA-LNP con diverse proprietà fisico-chimiche22. Qui, abbiamo formulato C12-200 mRNA-LNP con un rapporto molare di 35/16/46,5/2,5 (lipide ionizzabile:lipide helper:colesterolo:lipi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. riconosce il sostegno di un direttore del National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti (DP2 TR002776), di un Burroughs Wellcome Fund Career Award presso la Scientific Interface (CASI), di un premio alla carriera della National Science Foundation degli Stati Uniti (CBET-2145491) e di ulteriori finanziamenti da parte del National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 e NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
Riferimenti
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
