Indução de periodontite através de uma combinação de ligadura e injeção de lipopolissacarídeo em um modelo de rato
Summary
Neste estudo, um modelo de indução de periodontite em ratos é apresentado através de uma combinação de ligadura retentiva e injeções repetitivas de lipopolissacarídeo derivado de Porphyromonas gingivalis, durante 14 dias ao redor dos primeiros molares superiores. As técnicas de ligadura e injeção de LPS foram eficazes na indução de peridontite, resultando em perda óssea alveolar e inflamação.
Abstract
A periodontite (DP) é uma doença imuno-inflamatória crônica de alta prevalência do periodonto, que resulta em perda de tecido mole gengival, ligamento periodontal, cemento e osso alveolar. Neste estudo, um método simples de indução de DP em ratos é descrito. Fornecemos instruções detalhadas para a colocação do modelo de ligadura ao redor dos primeiros molares superiores (M1) e uma combinação de injeções de lipopolissacarídeo (LPS), derivado de Porphyromonas gingivalis na face mesio-palatal do M1. A indução da periodontite foi mantida por 14 dias, promovendo o acúmulo de biofilme bacteriano e inflamação. Para validar o modelo animal, a IL-1β, um mediador inflamatório chave, foi determinada por imunoensaio no fluido crevicular gengival (GCF), e a perda óssea alveolar foi calculada por meio da tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC). Esta técnica mostrou-se eficaz em promover recessão gengival, perda óssea alveolar e aumento dos níveis de IL-1β no GCF ao final do procedimento experimental após 14 dias. Esse método mostrou-se eficaz na indução da DP, podendo ser utilizado em estudos sobre mecanismos de progressão da doença e futuros possíveis tratamentos.
Introduction
A periodontite (DP) é a sexta condição de saúde pública mais prevalente no mundo, afetando aproximadamente 11% da população total, sendo uma forma avançada, irreversível e destrutiva da doença periodontal 1,2. A DP é um processo inflamatório que afeta os tecidos gengival e periodontal, resultando em recessão gengival, migração apical do epitélio juncional com desenvolvimento de bolsa e perda de osso alveolar3. Além disso, a DP está associada a várias doenças sistêmicas, incluindo doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes e artrite reumatoide, para as quais fatores ambientais e específicos do hospedeiro desempenham um papelsignificativo4,5.
Assim, a DP é uma doença multifatorial iniciada primariamente pelo acúmulo de placa microbiana – resultante da disbiose das comunidades microbianas – e por uma resposta imune exagerada do hospedeiro aos patógenos periodontais, o que leva à quebra do tecido periodontal 4,6. Dentre as várias bactérias periodontais, a bactéria anaeróbia gram-negativa Porphyromonas gingivalis é um dos principais patógenos na DP4. P. gingivalis contém um complexo lipopolissacarídeo (LPS) em suas paredes, molécula conhecida por induzir infiltração leucocitária polimorfonuclear e dilatação vascularem tecidos periodontais inflamados7. Isso resulta na produção de mediadores inflamatórios, como interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, fator de necrose tumoral (TNF) ou prostaglandinas, com subsequente ativação osteoclástica e reabsorção óssea, levando à destruição tecidual e perda dentária final3.
Entre as diferentes vantagens dos modelos animais estão a capacidade de mimetizar complexidades celulares como em humanos, ou de ser mais preciso do que estudos in vitro , que são realizados em superfícies plásticas com tipos celulareslimitados8. Para a modelagem experimental in vivo da DP, diferentes espécies animais têm sido utilizadas, como primatas não humanos, cães, porcos, furões, coelhos,camundongos e ratos9. No entanto, o rato é o modelo animal mais estudado para a patogênese da DP por ser de baixo custo e fácilmanuseio10. Seu tecido gengival dentário tem características estruturais semelhantes ao tecido gengival humano, com sulco gengival raso e epitélio juncional aderido à superfície dentária. Além disso, como em humanos, o epitélio juncional facilita a passagem de bactérias, materiais estranhos e exsudatos das células inflamatórias 9.
Um dos modelos experimentais de indução de DP em ratos mais relatados é a colocação de ligaduras ao redor dos dentes, o que é tecnicamente desafiador, masconfiável10. A colocação da ligadura facilita a placa dental e o acúmulo bacteriano, gerando uma disbiose nos sulcos gengivais, que causa inflamação e destruição do tecido periodontal11. A perda da inserção periodontal e da reabsorção do osso alveolar poderia ocorrer em 7 dias neste modelo derato8.
Outro modelo animal para DP consiste na injeção de LPS no tecido gengival. Como resultado, a osteoclastogênese e a perda óssea são estimuladas. As características histopatológicas desse modelo são semelhantes às da DP estabelecida pelo homem, caracterizada por maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias, degradação do colágeno e reabsorção óssea alveolar6,8.
Assim, o objetivo deste estudo foi descrever um modelo simples de DP experimental em ratos, baseado nas técnicas de injeção de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinado com a colocação de ligaduras ao redor dos primeiros molares superiores (M1). Trata-se de um modelo com características semelhantes às observadas na DP humana, que poderá ser utilizado no estudo dos mecanismos de progressão da doença e futuros possíveis tratamentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método descreve a indução de DP em ratos após uma técnica combinada de injeções de Pg-LPS e colocação de ligadura ao redor do M1, revelando que alterações significativas nos tecidos periodontais e no osso alveolar poderiam ser induzidas em 14 dias após esse método.
Durante este procedimento, deve-se prestar atenção às diferentes etapas críticas. Durante a anestesia do animal e o preparo do procedimento, avaliar a anestesia adequada durante o processo cirúrgico ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio da Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Prova de conceito 2020), do Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, cofinanciado pelo FSE Fundo Social Europeu e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do FEDER (contrato com M.M.B; FI18/00104) e pela Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (contrato com a M.M.F.C; FPI/040/2020). Os autores agradecem à Dra. Anna Tomás e Maria Tortosa pela ajuda na cirurgia experimental e plataforma do IdISBa. Finalmente, obrigado à Faculdade de Odontologia da ADEMA pelo acesso ao scanner CBCT.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Riferimenti
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