Visualisering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider via immunfluorescensanalyser
Summary
Denne protokollen beskriver metoder for evaluering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider. Inkludert her er omfattende pletterings- og fargemetoder, samt detaljerte, objektive kvantifiseringsprosedyrer.
Abstract
Immunfluorescens er en av de mest brukte teknikkene for å visualisere målantigener med høy følsomhet og spesifisitet, noe som muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av proteiner, glykaner og små molekyler. Mens denne teknikken er veletablert i todimensjonal (2D) cellekultur, er mindre kjent om bruken i tredimensjonale (3D) cellemodeller. Eggstokkreftorganoider er 3D-tumormodeller som rekapitulerer tumorcelle klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. Dermed er de overlegne cellelinjer for evaluering av legemiddelfølsomhet og funksjonelle biomarkører. Derfor er evnen til å utnytte immunfluorescens på primære eggstokkreftorganoider ekstremt gunstig for å forstå biologien til denne kreften. Den nåværende studien beskriver teknikken for immunfluorescens for å oppdage DNA-skadereparasjonsproteiner i høyverdige serøse pasientavledede eggstokkreftorganoider (PUD). Etter å ha utsatt PUDene for ioniserende stråling, utføres immunfluorescens på intakte organoider for å evaluere nukleære proteiner som foci. Bilder samles inn ved hjelp av z-stack-avbildning på konfokalmikroskopi og analyseres ved hjelp av automatisert programvare for focitelling. De beskrevne metodene tillater analyse av tidsmessig og spesiell rekruttering av DNA-skadereparasjonsproteiner og samlokalisering av disse proteinene med cellesyklusmarkører.
Introduction
Eggstokkreft er den viktigste dødsårsaken på grunn av gynekologisk malignitet. De fleste pasienter behandles med DNA-skadelige legemidler som karboplatin, og de med homolog rekombinasjonsreparasjon (HRR) -mangelfulle svulster kan gis poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hemmere 1,2. Imidlertid utvikler de fleste pasienter motstand mot disse terapiene og dør innen 5 år etter diagnosen. Dysregulering av DNA-skaderesponsen (DDR) har vært assosiert med utvikling av eggstokkreft og både kjemoterapi og PARP-hemmerresistens3. Dermed er studiet av DDR viktig for å forstå patofysiologien til eggstokkreft, potensielle biomarkører og nye målrettede terapier.
Nåværende metoder for å evaluere DDR benytter immunfluorescens (IF), da dette muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av DNA-skadeproteiner og nukleotidanaloger. Når det er en dobbeltstrenget pause (DSB) i DNA, blir histonproteinet H2AX raskt fosforylert, og danner et fokus der DNA-skadereparasjonsproteiner samles4. Denne fosforyleringen kan lett identifiseres ved hjelp av IF; faktisk har ɣ-H2AX-analysen ofte blitt brukt for å bekrefte induksjonen av en DSB 5,6,7,8,9. Økt DNA-skade har vært assosiert med platinafølsomhet og effekt av DNA-skadelige midler 10,11,12, og ɣ-H2AX har blitt foreslått som en biomarkør assosiert med kjemoterapirespons i andre kreftbehandlinger 13. På en DSB utfører en celle dyktig i HRR en rekke hendelser som fører til at BRCA1 og BRCA2 rekrutterer RAD51 for å erstatte replikasjonsprotein A (RPA) og binde seg til DNA. HRR-reparasjon bruker en DNA-mal for å reparere DSB trofast. Men når svulster er mangelfull i HRR, er de avhengige av alternative reparasjonsveier som ikke-homolog endekobling (NHEJ). NHEJ er kjent for å være utsatt for feil og skaper en høy mutasjonsbelastning på cellen, som bruker 53BP1 som en positiv regulator14. Disse DNA-skadeproteinene kan alle nøyaktig identifiseres som foci ved hjelp av IF. I tillegg til farging for proteiner, kan IF brukes til å studere gaffelbeskyttelse og enkeltstrenget DNA-gapdannelse. Evnen til å ha stabile gafler har vært korrelert med platinarespons, og nylig har gapanalyser vist potensialet til å forutsi responsen på PARP-hemmere 6,15,16,17. Derfor er farging for nukleotidanalogene etter innføring i genomet en annen måte å studere DDR på.
Hittil har evaluering av DDR i eggstokkreft i stor grad vært begrenset til homogene 2D-cellelinjer som ikke rekapitulerer den klonale heterogeniteten, mikromiljøet eller arkitekturen til in vivo-svulster 18,19. Nyere forskning tyder på at organoider er overlegne 2D-cellelinjer når de studerer komplekse biologiske prosesser som DDR-mekanismer6. Den nåværende metodikken evaluerer RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA og geminin i PUD. Disse metodene vurderer den intakte organoiden og tillater studier av DDR-mekanismer i en setting som ligner mer på in vivo-tumormikromiljøet. Sammen med konfokalmikroskopi og automatisert foci-telling, kan denne metoden hjelpe til med å forstå DDR-banen i eggstokkreft og tilpasse behandlingsplaner for pasienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-skaderesponsen spiller en integrert rolle i både utviklingen av eggstokkreft og kjemoterapiresistens. Derfor er en grundig forståelse av DNA-reparasjonsmekanismer avgjørende. Her presenteres en metodikk for å studere DNA-skadereparasjonsproteiner i 3D, intakte organoider. En reproduserbar, pålitelig protokoll er utviklet ved hjelp av kjennetegn antistoffer for å evaluere DNA-skade, homolog rekombinasjon, ikke-homolog slutt sammenføyning, og replikasjonsstress. Det er viktig at disse metodene valideres ved hjel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for veiledningen fra Pavel Lobachevsky, PhD i etableringen av denne protokollen. Vi vil også gjerne anerkjenne Washington University’s School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington Universitys Dean’s Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
Riferimenti
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Ricerca sul cancro. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Ricerca sul cancro. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Ricerca sul cancro. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
