Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência
Summary
O presente protocolo descreve métodos para avaliar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Aqui estão incluídos métodos abrangentes de chapeamento e coloração, bem como procedimentos de quantificação detalhados e objetivos.
Abstract
A imunofluorescência é uma das técnicas mais utilizadas para visualizar antígenos alvo com alta sensibilidade e especificidade, permitindo a identificação e localização precisas de proteínas, glicanos e pequenas moléculas. Embora esta técnica esteja bem estabelecida em cultura de células bidimensionais (2D), pouco se sabe sobre seu uso em modelos celulares tridimensionais (3D). Os organoides do câncer de ovário são modelos tumorais 3D que recapitulam a heterogeneidade clonal das células tumorais, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Assim, são superiores às linhagens celulares para a avaliação da sensibilidade a fármacos e biomarcadores funcionais. Portanto, a capacidade de utilizar a imunofluorescência em organoides primários de câncer de ovário é extremamente benéfica na compreensão da biologia desse câncer. O presente estudo descreve a técnica de imunofluorescência para detectar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário (DOP) de alto grau derivados de pacientes serosos. Após a exposição das DOP à radiação ionizante, a imunofluorescência é realizada em organoides intactos para avaliar as proteínas nucleares como focos. As imagens são coletadas usando imagens z-stack em microscopia confocal e analisadas usando software automatizado de contagem de focos. Os métodos descritos permitem a análise do recrutamento temporal e especial de proteínas de reparação de danos no DNA e a colocalização dessas proteínas com marcadores do ciclo celular.
Introduction
O câncer de ovário é a principal causa de morte por malignidade ginecológica. A maioria dos pacientes é tratada com medicamentos prejudiciais ao DNA, como a carboplatina, e aqueles com tumores deficientes em reparo homólogo de recombinação (HRR) podem receber inibidores da polipoli (ADP-ribose) polimerase (PARP) 1,2. No entanto, a maioria dos pacientes desenvolve resistência a essas terapias e morre dentro de 5 anos após o diagnóstico. A desregulação da resposta a danos no DNA (DDR) tem sido associada ao desenvolvimento de câncer de ovário e à resistência à quimioterapia e ao inibidor dePARP3. Assim, o estudo da DDR é imperativo na compreensão da fisiopatologia do câncer de ovário, potenciais biomarcadores e novas terapias direcionadas.
Os métodos atuais para avaliar a DDR utilizam imunofluorescência (FI), pois isso permite a identificação e localização precisas de proteínas de dano ao DNA e análogos de nucleotídeos. Uma vez que há uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA, a proteína histona H2AX é rapidamente fosforilada, formando um foco onde as proteínas de reparo de danos ao DNA se reúnem4. Esta fosforilação pode ser facilmente identificada utilizando IF; de fato, o ensaio ɣ-H2AX tem sido comumente empregado para confirmar a indução de um DSB 5,6,7,8,9. O aumento do dano ao DNA tem sido associado à sensibilidade à platina e à eficácia de agentes prejudiciais ao DNA 10,11,12, e ɣ-H2AX tem sido proposto como um biomarcador associado à resposta quimioterápica em outros tratamentos contra o câncer 13. Após um DSB, uma célula proficiente em HRR realiza uma série de eventos que levam o BRCA1 e o BRCA2 a recrutar RAD51 para substituir a proteína de replicação A (RPA) e se ligar ao DNA. O reparo HRR usa um modelo de DNA para reparar fielmente o DSB. No entanto, quando os tumores são deficientes em HRR, eles dependem de vias de reparo alternativas, como a junção final não homóloga (NHEJ). Sabe-se que o NHEJ é propenso a erros e cria uma alta carga mutacional na célula, que usa o 53BP1 como regulador positivo14. Essas proteínas de dano ao DNA podem ser identificadas com precisão como focos usando IF. Além da coloração para proteínas, o IF pode ser usado para estudar a proteção do garfo e a formação de lacunas de DNA de fita simples. A capacidade de ter garfos estáveis tem sido correlacionada com a resposta à platina e, recentemente, ensaios de gap mostraram o potencial de predizer a resposta aos inibidores de PARP 6,15,16,17. Portanto, a coloração para os análogos de nucleotídeos após a introdução no genoma é outra maneira de estudar a DDR.
Até o momento, a avaliação da DDR no câncer de ovário tem sido amplamente limitada a linhagens celulares 2D homogêneas que não recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente ou a arquitetura de tumores in vivo 18,19. Pesquisas recentes sugerem que os organoides são superiores às linhagens celulares 2D no estudo de processos biológicos complexos, como os mecanismos DDR6. A presente metodologia avalia RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina em DOP. Esses métodos avaliam o organoide intacto e permitem o estudo dos mecanismos de DDR em um ambiente mais semelhante ao microambiente tumoral di vivo. Juntamente com a microscopia confocal e a contagem automatizada de focos, essa metodologia pode ajudar na compreensão da via DDR no câncer de ovário e na personalização dos planos de tratamento para as pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A resposta a danos no DNA desempenha um papel integral no desenvolvimento do câncer de ovário e na resistência à quimioterapia. Portanto, uma compreensão completa dos mecanismos de reparo do DNA é imperativa. Aqui, uma metodologia é apresentada para estudar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides intactos 3D. Um protocolo reprodutível e confiável é desenvolvido utilizando anticorpos característicos para avaliar danos ao DNA, recombinação homóloga, junção final não homóloga e estresse de repli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pela orientação de Pavel Lobachevsky, PhD no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Reitor da Universidade de Washington, à Fundação do Grupo de Oncologia Ginecológica e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
Riferimenti
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