Visualisation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patients par des tests d’immunofluorescence
Summary
Le présent protocole décrit des méthodes d’évaluation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes. Vous trouverez ici des méthodes complètes de placage et de coloration, ainsi que des procédures de quantification détaillées et objectives.
Abstract
L’immunofluorescence est l’une des techniques les plus largement utilisées pour visualiser les antigènes cibles avec une sensibilité et une spécificité élevées, permettant l’identification et la localisation précises des protéines, des glycanes et des petites molécules. Bien que cette technique soit bien établie dans la culture cellulaire bidimensionnelle (2D), on en sait moins sur son utilisation dans les modèles cellulaires tridimensionnels (3D). Les organoïdes du cancer de l’ovaire sont des modèles tumoraux 3D qui récapitulent l’hétérogénéité clonale des cellules tumorales, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Ainsi, ils sont supérieurs aux lignées cellulaires pour l’évaluation de la sensibilité aux médicaments et des biomarqueurs fonctionnels. Par conséquent, la capacité d’utiliser l’immunofluorescence sur les organoïdes primaires du cancer de l’ovaire est extrêmement bénéfique pour comprendre la biologie de ce cancer. La présente étude décrit la technique d’immunofluorescence pour détecter les protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire (AOP) séreux dérivés de patients de haut grade. Après avoir exposé les PDO à des rayonnements ionisants, l’immunofluorescence est réalisée sur des organoïdes intacts pour évaluer les protéines nucléaires en tant que foyers. Les images sont collectées à l’aide de l’imagerie z-stack sur microscopie confocale et analysées à l’aide d’un logiciel automatisé de comptage des foyers. Les méthodes décrites permettent l’analyse du recrutement temporel et spécial des protéines de réparation des dommages à l’ADN et la colocalisation de ces protéines avec des marqueurs du cycle cellulaire.
Introduction
Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès dû à une malignité gynécologique. La majorité des patients sont traités avec des médicaments endommageant l’ADN tels que le carboplatine, et ceux qui ont des tumeurs déficientes en réparation de recombinaison homologue (HRR) peuvent recevoir des inhibiteurs de la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) 1,2. Cependant, la plupart des patients développent une résistance à ces thérapies et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic. La dysrégulation de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) a été associée au développement du cancer de l’ovaire et à la chimiothérapie et à la résistance aux inhibiteurs de PARP3. Ainsi, l’étude du DDR est impérative pour comprendre la physiopathologie du cancer de l’ovaire, les biomarqueurs potentiels et les nouvelles thérapies ciblées.
Les méthodes actuelles d’évaluation du DDR utilisent l’immunofluorescence (IF), car cela permet l’identification et la localisation précises des protéines de dommages à l’ADN et des analogues nucléotidiques. Une fois qu’il y a une cassure double brin (DSB) dans l’ADN, la protéine histones H2AX est rapidement phosphorylée, formant un foyer où les protéines de réparation des dommages à l’ADN se rassemblent4. Cette phosphorylation peut être facilement identifiée à l’aide de l’IF; en fait, le test ɣ-H2AX a été couramment utilisé pour confirmer l’induction d’un DSB 5,6,7,8,9. Une augmentation des dommages à l’ADN a été associée à la sensibilité au platine et à l’efficacité des agents endommageant l’ADN 10,11,12, et ɣ-H2AX a été proposé comme biomarqueur associé à la réponse à la chimiothérapie dans d’autres traitements contre le cancer 13. Lors d’un DSB, une cellule compétente en HRR effectue une série d’événements qui conduisent BRCA1 et BRCA2 à recruter RAD51 pour remplacer la protéine de réplication A (RPA) et se lier à l’ADN. La réparation HRR utilise un modèle d’ADN pour réparer fidèlement le DSB. Cependant, lorsque les tumeurs sont déficientes en HRR, elles s’appuient sur des voies de réparation alternatives telles que la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ). NHEJ est connu pour être sujet aux erreurs et crée une charge mutationnelle élevée sur la cellule, qui utilise 53BP1 comme régulateur positif14. Ces protéines de dommages à l’ADN peuvent toutes être identifiées avec précision comme foyers à l’aide de l’IF. En plus de la coloration des protéines, l’IF peut être utilisé pour étudier la protection de la fourchette et la formation de lacunes d’ADN simple brin. La capacité d’avoir des fourches stables a été corrélée avec la réponse du platine, et récemment, des tests d’écart ont montré le potentiel de prédire la réponse aux inhibiteurs de PARP 6,15,16,17. Par conséquent, la coloration des analogues nucléotidiques après introduction dans le génome est une autre façon d’étudier le DDR.
À ce jour, l’évaluation du DDR dans le cancer de l’ovaire a été largement limitée à des lignées cellulaires 2D homogènes qui ne récapitulent pas l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement ou l’architecture des tumeurs in vivo 18,19. Des recherches récentes suggèrent que les organoïdes sont supérieurs aux lignées cellulaires 2D dans l’étude de processus biologiques complexes tels que les mécanismes DDR6. La présente méthodologie évalue RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA et geminin dans les AOP. Ces méthodes évaluent l’organoïde intact et permettent d’étudier les mécanismes de DDR dans un cadre plus proche du microenvironnement tumoral in vivo. Avec la microscopie confocale et le comptage automatisé des foyers, cette méthodologie peut aider à comprendre la voie DDR dans le cancer de l’ovaire et à personnaliser les plans de traitement pour les patientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La réponse aux dommages à l’ADN joue un rôle essentiel dans le développement du cancer de l’ovaire et de la résistance à la chimiothérapie. Par conséquent, une compréhension approfondie des mécanismes de réparation de l’ADN est impérative. Ici, une méthodologie est présentée pour étudier les protéines de réparation des dommages à l’ADN dans des organoïdes 3D intacts. Un protocole reproductible et fiable est développé en utilisant des anticorps caractéristiques pour évaluer les dommages à …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Pavel Lobachevsky, Ph.D., de nous avoir guidés dans l’établissement de ce protocole. Nous tenons également à remercier l’École de médecine du Département d’obstétrique et de gynécologie et la Division d’oncologie gynécologique de l’Université de Washington à St. Louis, le Dean’s Scholar Program de l’Université de Washington, la Gynecologic Oncology Group Foundation et le Reproductive Scientist Development Program pour leur soutien à ce projet.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
Riferimenti
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