इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के माध्यम से रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन की कल्पना करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन के मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन करता है। यहां व्यापक चढ़ाना और धुंधला करने के तरीके शामिल हैं, साथ ही विस्तृत, उद्देश्य परिमाणीकरण प्रक्रियाएं भी हैं।
Abstract
इम्यूनोफ्लोरेसेंस उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ लक्ष्य एंटीजन की कल्पना करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक है, जिससे प्रोटीन, ग्लाइकेन और छोटे अणुओं की सटीक पहचान और स्थानीयकरण की अनुमति मिलती है। जबकि यह तकनीक दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित है, तीन आयामी (3 डी) सेल मॉडल में इसके उपयोग के बारे में कम जाना जाता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड 3 डी ट्यूमर मॉडल हैं जो ट्यूमर सेल क्लोनल विषमता, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, और सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को पुन: उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, वे दवा संवेदनशीलता और कार्यात्मक बायोमाकर्स के मूल्यांकन के लिए सेल लाइनों से बेहतर हैं। इसलिए, प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने की क्षमता इस कैंसर के जीव विज्ञान को समझने में बेहद फायदेमंद है। वर्तमान अध्ययन उच्च श्रेणी के सीरस रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तकनीक का वर्णन करता है। पीडीओ को आयनकारी विकिरण के लिए उजागर करने के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस को फॉसी के रूप में परमाणु प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए बरकरार ऑर्गेनोइड्स पर किया जाता है। छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर जेड-स्टैक इमेजिंग का उपयोग करके एकत्र किया जाता है और स्वचालित फॉसी काउंटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। वर्णित विधियां डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन की अस्थायी और विशेष भर्ती के विश्लेषण और सेल-चक्र मार्करों के साथ इन प्रोटीनों के सह-स्थानीयकरण की अनुमति देती हैं।
Introduction
डिम्बग्रंथि का कैंसर स्त्री रोग संबंधी दुर्भावना के कारण मृत्यु का प्रमुख कारण है। अधिकांश रोगियों को कार्बोप्लाटिन जैसी डीएनए-हानिकारक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है, और होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन रिपेयर (एचआरआर) की कमी वाले ट्यूमर वाले लोगों को पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ (पीएआरपी) इनहिबिटर 1,2 दिया जा सकता है। हालांकि, अधिकांश रोगी इन उपचारों के लिए प्रतिरोध विकसित करते हैं और निदान के 5 साल के भीतर मर जाते हैं। डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) की विकृति डिम्बग्रंथि के कैंसर और कीमोथेरेपी और पीएआरपी अवरोधक प्रतिरोध 3 दोनों के विकास से जुड़ी हुईहै। इस प्रकार, डिम्बग्रंथि के कैंसर, संभावित बायोमाकर्स और नए लक्षित उपचारों के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने में डीडीआर का अध्ययन अनिवार्य है।
डीडीआर का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान तरीके इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) का उपयोग करते हैं, क्योंकि यह डीएनए क्षति प्रोटीन और न्यूक्लियोटाइड एनालॉग की सटीक पहचान और स्थानीयकरण की अनुमति देता है। एक बार डीएनए में डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) होने के बाद, हिस्टोन प्रोटीन एच 2 ए एक्स तेजी से फॉस्फोराइलेटेड होता है, जिससे एक फोकस बनता है जहां डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन एकत्रहोते हैं। इस फॉस्फोराइलेशन को आईएफ का उपयोग करके आसानी से पहचाना जा सकता है; वास्तव में, डीएसबी 5,6,7,8,9 के प्रेरण की पुष्टि करने के लिए आमतौर पर एच-एच 2 ए एक्स परख का उपयोग किया गया है। बढ़ी हुई डीएनए क्षति को प्लैटिनम संवेदनशीलता और डीएनए हानिकारक एजेंटों की प्रभावकारिता 10,11,12 के साथ जोड़ा गया है, और अन्य कैंसर उपचारों में कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया से जुड़े बायोमार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है। डीएसबी पर, एचआरआर में कुशल एक सेल घटनाओं की एक श्रृंखला करता है जो बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 को प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) को बदलने और डीएनए से बांधने के लिए आरएडी 51 की भर्ती की ओर ले जाता है। एचआरआर मरम्मत डीएसबी को ईमानदारी से मरम्मत करने के लिए डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करती है। हालांकि, जब ट्यूमर एचआरआर में कमी होती है, तो वे वैकल्पिक मरम्मत मार्गों पर भरोसा करते हैं जैसे कि गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे)। NHEJ को त्रुटि-प्रवण माना जाता है और सेल पर एक उच्च उत्परिवर्तन बोझ पैदा करता है, जो सकारात्मक नियामक14 के रूप में 53BP1 का उपयोग करता है। इन डीएनए क्षति प्रोटीन को आईएफ का उपयोग करके फॉसी के रूप में सटीक रूप से पहचाना जा सकता है। प्रोटीन के लिए धुंधला होने के अलावा, आईएफ का उपयोग कांटा संरक्षण और एकल-फंसे डीएनए अंतर गठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। स्थिर कांटे रखने की क्षमता को प्लैटिनम प्रतिक्रिया के साथ सहसंबद्ध किया गया है, और हाल ही में, गैप परख ने पीएआरपी इनहिबिटर 6,15,16,17 की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने की क्षमता दिखाई है। इसलिए, जीनोम में परिचय के बाद न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स के लिए धुंधला होना डीडीआर का अध्ययन करने का एक और तरीका है।
आज तक, डिम्बग्रंथि के कैंसर में डीडीआर का मूल्यांकन काफी हद तक समरूप 2 डी सेल लाइनों तक सीमित है जो विवो ट्यूमर18,19 में क्लोनल विषमता, माइक्रोएन्वायरमेंट या वास्तुकला को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। हाल के शोध से पता चलता है कि डीडीआर तंत्र6 जैसे जटिल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में ऑर्गेनोइड 2 डी सेल लाइनों से बेहतर हैं। वर्तमान पद्धति पीडीओ में RAD51, O-H2AX, 53BP1, RPA और जेमिनिन का मूल्यांकन करती है। ये विधियां बरकरार ऑर्गेनोइड का आकलन करती हैं और विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के समान सेटिंग में डीडीआर तंत्र के अध्ययन की अनुमति देती हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और स्वचालित फॉसी गिनती के साथ, यह पद्धति डिम्बग्रंथि के कैंसर में डीडीआर मार्ग को समझने और रोगियों के लिए उपचार योजनाओं को निजीकृत करने में सहायता कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए क्षति प्रतिक्रिया डिम्बग्रंथि के कैंसर और कीमोथेरेपी प्रतिरोध दोनों के विकास में एक अभिन्न भूमिका निभाती है। इसलिए, डीएनए मरम्मत तंत्र की पूरी तरह से समझ अनिवार्य है। यहां, 3 डी, बरकरार ऑर्गेनोइ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने में पावेल लोबाचेवस्की, पीएचडी के मार्गदर्शन के लिए आभारी हैं। हम इस परियोजना के समर्थन के लिए सेंट लुइस के प्रसूति और स्त्री रोग विभाग और स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी विभाग, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के डीन स्कॉलर प्रोग्राम, स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी ग्रुप फाउंडेशन और प्रजनन वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन को भी स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
Riferimenti
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