En protokoll for å evaluere og kvantifisere retinale pigmenterte epitelpatologier i musemodeller av aldersrelatert makuladegenerasjon

Summary

Musemodeller kan være nyttige verktøy for å undersøke biologien til retinalpigmentert epitel (RPE). Det har blitt fastslått at mus kan utvikle en rekke RPE-patologier. Her beskriver vi en fenotypingsprotokoll for å belyse og kvantifisere RPE-patologier hos mus ved hjelp av lys, transmisjonselektron og konfokalmikroskopi.

Abstract

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en svekkende retinal lidelse i aldrende befolkninger. Det er allment antatt at dysfunksjon av retinalpigmentert epitel (RPE) er en viktig patobiologisk hendelse i AMD. For å forstå mekanismene som fører til RPE-dysfunksjon, kan musemodeller brukes av forskere. Det har blitt fastslått av tidligere studier at mus kan utvikle RPE-patologier, hvorav noen observeres i øynene til personer diagnostisert med AMD. Her beskriver vi en fenotypingsprotokoll for å vurdere RPE-patologier hos mus. Denne protokollen inkluderer fremstilling og evaluering av retinale tverrsnitt ved bruk av lysmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi, samt RPE-flatfester ved konfokalmikroskopi. Vi beskriver de vanlige typene murine RPE-patologier observert av disse teknikkene og måter å kvantifisere dem gjennom objektive metoder for statistisk testing. Som bevis på konsept bruker vi denne RPE-fenotypingsprotokollen for å kvantifisere RPE-patologiene observert hos mus som overuttrykker transmembranprotein 135 (Tmem135) og eldre C57BL/6J-mus av villtype C57BL/6J. Hovedmålet med denne protokollen er å presentere standard RPE-fenotypingsmetoder med objektive kvantitative vurderinger for forskere som bruker musemodeller av AMD.

Introduction

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en vanlig blindende sykdom som rammer populasjoner over 55 år¹. Mange forskere mener at dysfunksjon i retinalpigmentert epitel (RPE) er en tidlig og avgjørende patobiologisk hendelse i AMD². RPE er et monolag av polariserte celler som har til oppgave å opprettholde homeostasen til nærliggende fotoreceptorer og koroidale blodkar³. Det finnes en rekke modeller for å undersøke sykdomsassosierte mekanismer i RPE, inkludert cellekulturmodeller ^4,5 og mus 6,7,8. En fersk rapport har beskrevet standardiserte protokoller og kvalitetskontrollkriterier for RPE-cellekulturmodeller⁴, men ingen rapport har forsøkt å standardisere fenotypingen av RPE i musemodeller. Faktisk mangler mange publikasjoner på musemodeller av AMD en fullstendig beskrivelse av RPE eller kvantifisering av RPE-patologiene i dem. Det overordnede målet med denne protokollen er å presentere standard RPE-fenotypingsmetoder med objektive kvantitative vurderinger for forskere som bruker AMD-musemodeller.

Tidligere publikasjoner har notert tilstedeværelsen av flere RPE-patologier hos mus gjennom tre bildebehandlingsteknikker. For eksempel tillater lysmikroskopi forskere å se brutto morfologi av murine retina (figur 1A) og oppdage RPE-patologier som RPE-tynning, vakuolisering og migrasjon. RPE-tynning i en AMD-musemodell eksemplifiseres av et avvik i RPE-høyden fra deres respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan deles inn i to separate kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) og makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering er oppsummert ved tilstedeværelsen av vakuoler i RPE som ikke påvirker dens totale høyde, mens makrovakuolisering indikeres av tilstedeværelsen av vakuoler som stikker ut i de ytre segmentene av fotoreceptorene. RPE-migrasjon kjennetegnes ved fokalaggregatet av pigment over RPE-monolaget i et retinalt tverrsnitt (figur 1E). Det skal bemerkes at migrerende RPE-celler i AMD-donorøyne utviser immunoreaktivitet mot immuncellemarkører, for eksempel klynge av differensiering 68 (CD68) 9, og kan representere immunceller som oppsluker RPE-rusk eller RPE som gjennomgår transdifferensiering ⁹. En annen bildebehandlingsteknikk kalt transmisjonselektronmikroskopi kan tillate forskere å visualisere ultrastrukturen til RPE og dens kjellermembran (figur 2A). Denne teknikken kan identifisere den dominerende sub-RPE-forekomsten hos mus, kjent som basal laminær forekomst (BLamD) (figur 2B)¹⁰. Til slutt kan konfokalmikroskopi avsløre strukturen til RPE-celler gjennom avbildning av RPE-flatfester (figur 3A). Denne metoden kan avdekke RPE-dysmorfi, avviket fra RPE fra sin klassiske bikakeform (figur 3B). Det kan også oppdage RPE multinukleasjon, tilstedeværelsen av tre eller flere kjerner i en RPE-celle (figur 3C). For et sammendrag av hvilke typer RPE-patologier som er tilstede i dagens AMD-musemodeller, henviser vi forskere til disse vurderingene fra litteraturen ^6,7.

Forskere som studerer AMD bør være oppmerksomme på fordelene og ulempene ved å bruke mus til å undersøke RPE-patologier før fenotypingsprotokollen. Mus er fordelaktige på grunn av deres relativt korte levetid og kostnadseffektivitet, samt deres genetiske og farmakologiske manipulerbarhet. Mus viser også RPE-degenerative endringer, inkludert RPE-migrasjon, dysmorfi og multinukleering, som observeres i AMD-donorøyne 11,12,13,14,15,16,17; Dette antyder at lignende mekanismer kan ligge til grunn for utviklingen av disse RPE-patologiene hos mus og mennesker. Imidlertid er det viktige forskjeller som begrenser oversettbarheten av musestudier til human AMD. For det første har mus ikke en makula, en anatomisk distinkt region av den menneskelige netthinnen som er nødvendig for synsstyrke som fortrinnsvis påvirkes i AMD. For det andre er noen RPE-patologier hos mus, som RPE-tynning og vakuolisering, vanligvis ikke sett i AMD-donorøyne¹⁸. For det tredje utvikler mus ikke drusen, et kjennetegn ved AMD-patologi¹⁹. Drusen er lipid- og proteinholdige avleiringer med svært få kjellermembranproteiner som dannes mellom RPE basal lamina og det indre kollagenøse laget av Bruchs membran (BrM)¹⁹. Drusen skiller seg fra BLamD, den vanlige sub-RPE-forekomsten hos mus, både i sammensetning og anatomisk plassering. BLamDs er alders- og stressavhengige ekstracellulære matriksberikede abnormiteter som dannes mellom RPE basal lamina av BrM og de basale infoldingene av RPE²⁰. Interessant nok har BLamDs en lignende proteinsammensetning og utseende hos både mus og mennesker ^6,10,21. Nylig arbeid tyder på at BLamDs kan virke i patobiologien til AMD ved å påvirke utviklingen av AMD til sine senere stadier^18,22; Dermed kan disse forekomstene representere syk RPE i musehinnen. Kunnskap om disse fordelene og begrensningene er avgjørende for forskere som er interessert i å oversette resultater fra musestudier til AMD.

I denne protokollen diskuterer vi metodene for å forberede øynene på lys, transmisjonselektron og konfokalmikroskopi for å visualisere RPE-patologier. Vi beskriver også hvordan man kvantifiserer RPE-patologier på en objektiv måte for statistisk testing. Som bevis på konsept bruker vi RPE-fenotypingsprotokollen for å undersøke de strukturelle RPE-patologiene observert i transmembranprotein 135- (Tmem135) som overuttrykker mus og alderen villtype (WT) C57BL/6J-mus. Oppsummert tar vi sikte på å beskrive fenotypingsmetodikken for å karakterisere RPE i AMD-musemodeller, siden det for øyeblikket ikke er noen standardprotokoller tilgjengelig. Forskere som er interessert i å undersøke og kvantifisere patologier av fotoreceptorene eller choroid, som også påvirkes i AMD-musemodeller, kan ikke finne denne protokollen nyttig for sine studier.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyreforsøk, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Wisconsin-Madison, og er i samsvar med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. 1. Evaluering av mus RPE ved lysmikroskopi Lag en fiksativ buffer som har en endelig konsentrasjon på 2% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd ved romtemperatur (RT) i en glassflaske.<…

Representative Results

Fullføring av RPE-fenotypingsprotokollen beskrevet i denne artikkelen gir en kvantitativ analyse av strukturelle RPE-abnormiteter som ofte observeres i musemodeller av AMD. For å bekrefte effektiviteten av denne protokollen brukte vi den på mus som er kjent for å vise RPE-patologier, inkludert transgene mus som overuttrykker WT Tmem135 drevet av kyllingens beta-aktinpromotor (Tmem135 TG)30 og alderen C57BL/6J-mus31,32.</sup…

Discussion

I denne artikkelen introduserte vi en fenotypingsprotokoll for å vurdere de strukturelle RPE-patologiene til musemodeller. Vi beskrev trinnene som kreves for å behandle øynene for ulike bildebehandlingsteknikker, inkludert lys, transmisjonselektron og konfokal mikroskopi, samt kvantifisering av typiske patologier observert via disse bildebehandlingsmetodene. Vi beviste effektiviteten av vår RPE-fenotypingsprotokoll ved å undersøke Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus, siden disse musene viser RP…

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02