Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Summary

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Abstract

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine schwächende Netzhauterkrankung in alternden Bevölkerungen. Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysfunktion des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein wichtiges pathobiologisches Ereignis bei AMD ist. Um die Mechanismen zu verstehen, die zu einer RPE-Dysfunktion führen, können Mausmodelle von Forschern verwendet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mäuse RPE-Pathologien entwickeln können, von denen einige in den Augen von Personen beobachtet werden, bei denen AMD diagnostiziert wurde. Hier beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung von RPE-Pathologien in Mäusen. Dieses Protokoll umfasst die Präparation und Auswertung von Netzhautquerschnitten mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sowie von RPE-Flachfassungen mittels konfokaler Mikroskopie. Wir beschreiben detailliert die häufigsten Arten von murinen RPE-Pathologien, die mit diesen Techniken beobachtet werden, und Möglichkeiten, sie durch unvoreingenommene Methoden für statistische Tests zu quantifizieren. Als Proof-of-Concept verwenden wir dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die RPE-Pathologien zu quantifizieren, die bei Mäusen mit Überexpression des Transmembranproteins 135 (Tmem135) und gealterten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurden. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Standardmethoden zur RPE-Phänotypisierung mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler zu präsentieren, die Mausmodelle der AMD verwenden.

Introduction

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft¹. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD² ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten³. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle^4,5 und Mäuse ^6,7,8. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurden standardisierte Protokolle und Qualitätskontrollkriterien für RPE-Zellkulturmodelle^{beschrieben 4}, jedoch wurde in keinem Bericht versucht, die Phänotypisierung des RPE in Mausmodellen zu standardisieren. Tatsächlich fehlt in vielen Veröffentlichungen zu Mausmodellen der AMD eine vollständige Beschreibung des RPE oder eine Quantifizierung der RPE-Pathologien in ihnen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Standard-RPE-Phänotypisierungsmethoden mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler mit AMD-Mausmodellen zu präsentieren.

Frühere Veröffentlichungen haben das Vorhandensein mehrerer RPE-Pathologien bei Mäusen durch drei bildgebende Verfahren festgestellt. Die Lichtmikroskopie ermöglicht es Forschern beispielsweise, die grobe Morphologie der murinen Netzhaut zu betrachten (Abbildung 1A) und RPE-Pathologien wie RPE-Verdünnung, Vakuolisierung und Migration zu erkennen. Die RPE-Ausdünnung in einem AMD-Mausmodell wird durch eine Abweichung der RPE-Höhe von den jeweiligen Kontrollen veranschaulicht (Abbildung 1B). Die RPE-Vakuolisierung kann in zwei separate Kategorien unterteilt werden: Mikrovakuolisierung (Abbildung 1C) und Makrovakuolisierung (Abbildung 1D). Die RPE-Mikrovakuolisierung wird durch das Vorhandensein von Vakuolen im RPE zusammengefasst, die seine Gesamthöhe nicht beeinflussen, während die Makrovakuolisierung durch das Vorhandensein von Vakuolen angezeigt wird, die in die äußeren Segmente der Photorezeptoren hineinragen. Die RPE-Migration wird durch das fokale Pigmentaggregat oberhalb der RPE-Monoschicht in einem Netzhautquerschnitt unterschieden (Abbildung 1E). Es sollte beachtet werden, dass migrierende RPE-Zellen in AMD-Spenderaugen Immunreaktivität gegenüber Immunzellmarkern wie dem Cluster of Differentiation 68 (CD68)⁹ aufweisen und Immunzellen darstellen könnten, die RPE-Trümmer verschlingen, oder RPE, die sich einer^{Transdifferenzierung} unterziehen9. Ein weiteres bildgebendes Verfahren, die sogenannte Transmissionselektronenmikroskopie, kann es den Forschern ermöglichen, die Ultrastruktur des RPE und seiner Basalmembran sichtbar zu machen (Abbildung 2A). Mit dieser Technik kann die vorherrschende Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen identifiziert werden, die als basale laminare Ablagerung (BLamD) bekannt ist (Abbildung 2B)¹⁰. Schließlich kann die konfokale Mikroskopie die Struktur von RPE-Zellen durch die Abbildung von RPE-Flachhalterungen aufdecken (Abbildung 3A). Mit dieser Methode kann die RPE-Dysmorphie, die Abweichung des RPE von seiner klassischen Wabenform (Abbildung 3B), aufgedeckt werden. Es kann auch die RPE-Mehrkernbildung erkennen, d. h. das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen innerhalb einer RPE-Zelle (Abbildung 3C). Für eine Zusammenfassung der Arten von RPE-Pathologien, die in aktuellen AMD-Mausmodellen vorhanden sind, verweisen wir Forscher auf diese Übersichtsarbeiten aus der Literatur ^6,7.

Forscher, die AMD untersuchen, sollten sich der Vor- und Nachteile der Verwendung von Mäusen zur Untersuchung von RPE-Pathologien vor dem Phänotypisierungsprotokoll bewusst sein. Mäuse zeichnen sich durch ihre relativ kurze Lebensdauer und Kosteneffizienz sowie ihre genetische und pharmakologische Manipulierbarkeit aus. Mäuse weisen auch degenerative RPE-Veränderungen auf, einschließlich RPE-Migration, Dysmorphie und Mehrkernbildung, die in AMD-Spenderaugen beobachtet werden 11,12,13,14,15,16,17; Dies deutet darauf hin, dass ähnliche Mechanismen der Entwicklung dieser RPE-Pathologien bei Mäusen und Menschen zugrunde liegen könnten. Es gibt jedoch wesentliche Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Mausstudien auf die menschliche AMD einschränken. Erstens haben Mäuse keine Makula, eine anatomisch unterschiedliche Region der menschlichen Netzhaut, die für die Sehschärfe notwendig ist und bei AMD bevorzugt betroffen ist. Zweitens werden einige RPE-Pathologien bei Mäusen, wie z. B. RPE-Verdünnung und Vakuolisierung, typischerweise nicht in AMD-Spenderaugen beobachtet¹⁸. Drittens entwickeln Mäuse keine Drusen, ein Kennzeichen der AMD-Pathologie¹⁹. Drusen sind lipid- und proteinhaltige Ablagerungen mit sehr wenigen Basalmembranproteinen, die sich zwischen der RPE-Basallamina und der inneren kollagenen Schicht der Bruchschen Membran (BrM) ^bilden19. Drusen unterscheiden sich sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer anatomischen Lage von BLamD, der häufigen Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen. BLamDs sind alters- und stressabhängige extrazelluläre Matrix-angereicherte Anomalien, die sich zwischen der RPE-Basallamina von BrM und den basalen Infoldings des RPE²⁰ bilden. Interessanterweise haben BLamDs sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen eine ähnliche Proteinzusammensetzung und ein ähnliches Aussehen ^6,10,21. Neuere Arbeiten deuten darauf hin, dass BLamDs in der Pathobiologie der AMD eine Rolle spielen können, indem sie das Fortschreiten der AMD in ihre späteren Stadien beeinflussen^18,22; Daher können diese Ablagerungen erkranktes RPE in der Netzhaut der Maus darstellen. Das Wissen um diese Vorteile und Einschränkungen ist für Forscher, die daran interessiert sind, Ergebnisse aus Mausstudien auf AMD zu übertragen, von entscheidender Bedeutung.

In diesem Protokoll diskutieren wir die Methoden zur Vorbereitung der Augen auf Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie zur Visualisierung von RPE-Pathologien. Wir beschreiben auch, wie RPE-Pathologien für statistische Tests unvoreingenommen quantifiziert werden können. Als Proof-of-Concept verwenden wir das RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die strukturellen RPE-Pathologien zu untersuchen, die in transmembranprotein 135- (Tmem135) überexprimierenden Mäusen und gealterten Wildtyp (WT) C57BL/6J Mäusen beobachtet wurden. Zusammenfassend ist es unser Ziel, die Phänotypisierungsmethodik zur Charakterisierung des RPE in AMD-Mausmodellen zu beschreiben, da derzeit keine Standardprotokolle verfügbar sind. Forscher, die daran interessiert sind, Pathologien der Photorezeptoren oder der Aderhaut zu untersuchen und zu quantifizieren, die auch in AMD-Mausmodellen betroffen sind, finden dieses Protokoll möglicherweise nicht nützlich für ihre Studien.

Protocol

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Wisconsin-Madison genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. 1. Auswertung des RPE der Maus mittels Lichtmikroskopie Stellen Sie in einer Glasflasche einen Fixierpuffer mit einer Endkonzentration von 2 % Parafor…

Representative Results

Die Vervollständigung des in diesem Artikel beschriebenen RPE-Phänotypisierungsprotokolls bietet eine quantitative Analyse der strukturellen RPE-Anomalien, die häufig in Mausmodellen der AMD beobachtet werden. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu bestätigen, verwendeten wir es bei Mäusen, von denen bekannt ist, dass sie RPE-Pathologien aufweisen, einschließlich transgener Mäuse, die WT Tmem135 überexprimieren, angetrieben durch den Huhn-Beta-Aktin-Promotor (Tmem135 TG)30, und gealterte C57BL/6J-Mäuse…

Discussion

In diesem Artikel haben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung der strukturellen RPE-Pathologien von Mausmodellen vorgestellt. Wir beschrieben die Schritte, die für die Verarbeitung der Augen für verschiedene bildgebende Verfahren wie Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie erforderlich sind, sowie die Quantifizierung typischer Pathologien, die mit diesen bildgebenden Verfahren beobachtet werden. Wir haben die Wirksamkeit unseres RPE-Phänotypisierungsprotokolls durch die Unters…

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02