Summary

加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

Published: March 10, 2023
doi:

Summary

マウスモデルは、網膜色素上皮(RPE)の生物学を調べるための有用なツールとなり得る。マウスは一連のRPE病理を発症する可能性があることが確立されています。ここでは、光、透過電子、および共焦点顕微鏡を使用してマウスのRPE病理を解明および定量化するための表現型プロトコルについて説明します。

Abstract

加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者における衰弱性網膜障害です。網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの重要な病態学的事象であると広く信じられています。RPE機能障害につながるメカニズムを理解するために、研究者はマウスモデルを利用することができます。以前の研究により、マウスはRPEの病状を発症する可能性があり、その一部はAMDと診断された個人の目に観察されることが確立されています。ここでは、マウスのRPE病態を評価するための表現型プロトコールについて説明します。このプロトコルには、光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡を使用した網膜断面の準備と評価、および共焦点顕微鏡によるRPEフラットマウントの標本の作成と評価が含まれます。これらの手法によって観察されるマウスRPEの病状の一般的なタイプと、統計的検定のための偏りのない方法を通じてそれらを定量化する方法について詳しく説明します。概念実証として、このRPE表現型プロトコルを使用して、膜貫通タンパク質135(Tmem135)を過剰発現するマウスおよび野生型C57BL/6Jの老化マウスで観察されたRPEの病状を定量化しました。このプロトコルの主な目的は、AMDのマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を伴う標準的なRPE表現型分析法を提示することです。

Introduction

加齢黄斑変性症(AMD)は、55歳以上の人々に影響を与える一般的な失明性疾患です1。多くの研究者は、網膜色素上皮(RPE)内の機能不全は、AMD2の早期かつ重要な病態学的事象であると考えています。RPEは、隣接する視受容体と脈絡膜血管の恒常性を維持する役割を負った偏光細胞の単層です3。RPE内の疾患関連メカニズムを調べるために、細胞培養モデル45、マウス678など、さまざまなモデルが存在します。最近の報告では、RPE細胞培養モデル4の標準化されたプロトコルと品質管理基準が記載されているが、マウスモデルにおけるRPEの表現型を標準化しようとした報告はない。実際、AMDのマウスモデルに関する多くの出版物には、RPEの完全な説明やRPEの病状の定量化が欠けています。このプロトコルの全体的な目標は、AMDマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を備えた標準的なRPE表現型分析法を提示することです。

以前の出版物は、3つの画像技術を通じてマウスにおけるいくつかのRPE病理の存在を指摘している。たとえば、光学顕微鏡法により、研究者はマウス網膜の肉眼的形態を観察し(図1A)、RPEの菲薄化、空胞化、移動などのRPEの病状を検出できます。AMDマウスモデルにおけるRPEの薄化は、それぞれのコントロールからのRPEの高さの偏差によって例示されます(図1B)。RPE空胞化は、微小液胞化(図1C)とマクロ液胞化(図1D)の2つのカテゴリーに分けることができます。RPE微小液胞化は、その全体の高さに影響を及ぼさないRPE内の液胞の存在によって要約されるが、マクロ液胞化は、光受容体の外側セグメントに突出する液胞の存在によって示される。RPEの移動は、網膜断面におけるRPE単層上の色素の焦点集合体によって区別されます(図1E)。AMDドナーの眼における遊走性RPE細胞は、分化クラスター68(CD68)9などの免疫細胞マーカーに対して免疫反応性を示し、RPE破片または分化形質転換を受けているRPEを巻き込む免疫細胞を表す可能性があることに注意する必要があります9透過型電子顕微鏡と呼ばれる別のイメージング技術により、研究者はRPEとその基底膜の微細構造を視覚化することができます(図2A)。この手法により、基底層流沈着(BLamD)として知られるマウスの優勢なサブRPE沈着物を特定することができます(図2B)10。最後に、共焦点顕微鏡は、RPEフラットマウントのイメージングを通じてRPE細胞の構造を明らかにすることができます(図3A)。この方法により、RPE異形症、つまりRPEの古典的なハニカム形状からの偏差を明らかにすることができます(図3B)。また、RPE細胞内に3つ以上の核が存在するRPE多核化を検出することもできます(図3C)。現在のAMDマウスモデルに存在するRPE病理の種類の要約については、文献6,7からこれらのレビューを参照します。

AMDを研究している研究者は、表現型プロトコルの前にマウスを使用してRPEの病状を調査することの長所と短所を知っておく必要があります。マウスは、それらの比較的短い寿命および費用対効果、ならびにそれらの遺伝的および薬理学的操作性のために有利である。マウスはまた、RPE遊走、異形症、および多核形成を含むRPE変性変化を示し、AMDドナー眼で観察される11、12、13、14、151617;これは、同様のメカニズムがマウスとヒトにおけるこれらのRPE病状の発症の根底にある可能性があることを示唆しています。ただし、マウス研究のヒトAMDへの翻訳可能性を制限する重要な違いがあります。第一に、マウスには、AMDで優先的に影響を受ける視力に必要な人間の網膜の解剖学的に異なる領域である黄斑がありません。第二に、RPEの菲薄化や空胞化など、マウスの一部のRPE病理は、通常、AMDドナーの目には見られません18。第三に、マウスはAMD病理の特徴であるドルーゼンを発症しません19。ドルーゼンは脂質およびタンパク質を含む沈着物であり、RPE基底膜とブルッフ膜(BrM)の内側コラーゲン層との間に形成される基底膜タンパク質はほとんどありません19。ドルーゼンは、マウスの一般的なサブRPE沈着物であるBLamDとは、その組成と解剖学的位置の両方が異なります。BLamDは、BrMのRPE基底膜とRPE20の基底折り畳みとの間に形成される、年齢およびストレス依存性の細胞外マトリックスに富む異常です。興味深いことに、BLamDはマウスとヒトの両方で同様のタンパク質組成と外観を持っています61021。最近の研究は、BLamDがAMDの後期段階への進行に影響を与えることによってAMDの病態生物学において作用する可能性があることを示唆しています18,22;したがって、これらの沈着物は、マウス網膜における罹患RPEを表し得る。これらの利点と限界に関する知識は、マウス研究の結果をAMDに変換することに関心のある研究者にとって重要です。

このプロトコルでは、RPEの病状を視覚化するために、光、透過電子、および共焦点顕微鏡のために目を準備する方法について説明します。また、統計的検定のためにRPEの病状を偏りのない方法で定量化する方法についても説明します。概念実証として、RPE表現型プロトコルを利用して、膜貫通タンパク質135-(Tmem135)過剰発現マウスおよび老化野生型(WT)C57BL/6Jマウスで観察された構造的RPE病理を調査します。要約すると、現在利用可能な標準プロトコルがないため、AMDマウスモデルでRPEを特徴付けるための表現型決定方法論を説明することを目的としています。AMDマウスモデルでも影響を受ける光受容体または脈絡膜の病状の調査と定量化に関心のある研究者は、このプロトコルが研究に役立たない可能性があります。

Protocol

動物を対象とするすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物管理および使用委員会によって承認されており、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明に準拠しています。 1. 光学顕微鏡によるマウスRPEの評価 ガラス瓶に室温(RT)で最終濃度が2%のパラホルムアルデヒドと2%のグルタルアルデヒ?…

Representative Results

この記事に記載されているRPE表現型プロトコルの完成により、AMDのマウスモデルで一般的に観察される構造的RPE異常の定量的分析が可能になります。このプロトコルの有効性を確認するために、ニワトリベータアクチンプロモーター(Tmem135 TG)30によって駆動されるWT Tmem135を過剰発現するトランスジェニックマウスや、高齢のC57BL/6Jマウス31,32<sup class="xref…

Discussion

本稿では、マウスモデルの構造的RPE病理を評価するための表現型プロトコールについて紹介しました。光、透過電子、共焦点顕微鏡など、さまざまなイメージング技術のために眼を処理するために必要な手順と、これらのイメージング方法で観察される典型的な病状の定量について説明しました。Tmem135 TGおよび24ヶ月齢のWTマウスはRPE病理30,31,32<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、木下聡とウィスコンシン大学(UW)の病理学研究所(TRIP)におけるトランスレーショナルリサーチイニシアチブが、光学顕微鏡用に組織を調製してくれたことに感謝したいと思います。このコアは、ウィスコンシン大学炭素がんセンターのUW病理学および検査医学部門(P30 CA014520)、およびNIH所長室(S10OD023526)によってサポートされています。共焦点顕微鏡は、UW生化学基金の支援を受けて設立されたUW生化学光学コアで実施されました。この研究は、国立眼科研究所からの助成金によっても支援されました(R01EY022086から池田敦;R01EY031748からC.ボウズリックマンへ。P30EY016665をUWの眼科および視覚科学科に。デュークアイセンターへのP30EY005722。NIH T32EY027721からM.ランドウスキーへ。F32EY032766からM.ランドウスキーへ)、ティモシーウィリアムトラウト会長(池田A)、FFBフリーファミリーAMDアワード(C.ボウズリックマン);失明を防ぐための研究(デュークアイセンター)からの無制限の助成金。

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch’s membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch’s membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch’s membrane in mice. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye – a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

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Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

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