Het huidige protocol beschrijft hoe een FeCl 3-gemedieerd letsel kan worden gebruikt om arteriële trombose te induceren en hoe arteriële letselmonsters in verschillende stadia van trombose kunnen worden verzameld en voorbereid voor elektronenmicroscopieanalyse.
Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van sterfte en morbiditeit. Aberrante trombose is een gemeenschappelijk kenmerk van systemische aandoeningen zoals diabetes en obesitas, en chronische ontstekingsziekten zoals atherosclerose, kanker en auto-immuunziekten. Bij vasculair letsel werken meestal het stollingssysteem, de bloedplaatjes en het endotheel op een georkestreerde manier om bloedingen te voorkomen door een stolsel te vormen op de plaats van het letsel. Afwijkingen in dit proces leiden tot overmatige bloedingen of ongecontroleerde trombose / onvoldoende antitrombotische activiteit, wat zich vertaalt in vaatocclusie en de gevolgen ervan. Het FeCl 3-geïnduceerde carotisletselmodel is een waardevol hulpmiddel om te onderzoeken hoe trombose in vivo begint en vordert. Dit model omvat endotheelschade / denudatie en daaropvolgende stolselvorming op de gewonde plaats. Het biedt een zeer gevoelige, kwantitatieve test om vasculaire schade en stolselvorming te controleren als reactie op verschillende graden van vasculaire schade. Eenmaal geoptimaliseerd, kan deze standaardtechniek worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan trombose, evenals de ultrastructurele veranderingen in bloedplaatjes in een groeiende trombus. Deze test is ook nuttig om de werkzaamheid van antitrombotische en bloedplaatjesaggregatieremmers te bestuderen. In dit artikel wordt uitgelegd hoe fecl 3-geïnduceerde arteriële trombose kan worden geïnitieerd en gecontroleerd en hoe monsters kunnen worden verzameld voor analyse door elektronenmicroscopie.
Trombose is de vorming van een bloedstolsel dat een bloedvat gedeeltelijk of volledig blokkeert, waardoor de natuurlijke doorstroming van het bloed wordt belemmerd. Dit leidt tot ernstige en fatale cardiovasculaire gebeurtenissen, zoals ischemische hartziekten en beroertes. Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit en veroorzaken wereldwijd eenop de vier sterfgevallen 1,2,3. Hoewel trombose zich manifesteert als een storing van het vasculaire systeem, kan het een gevolg zijn van een onderliggende microbiële of virale infectie, immuunstoornis, maligniteit of metabole aandoening. De bloedstroom wordt in stand gehouden door de complexe interactie tussen verschillende componenten van het vasculaire systeem, waaronder endotheelcellen, rood/witte bloedcellen, bloedplaatjes en stollingsfactoren4. Bij vasculair letsel interageren bloedplaatjes met kleefeiwitten op de subendotheliale matrix en geven hun korrelige inhoud vrij, die meer bloedplaatjes rekruteren5. Tegelijkertijd wordt de stollingscascade geactiveerd, wat leidt tot fibrinevorming en afzetting. Uiteindelijk wordt een stolsel gevormd, met bloedplaatjes en rode bloedcellen gevangen in een fibrine-mesh6. Hoewel bloedplaatjesaggregatieremmers en anticoagulantia beschikbaar zijn om trombose te moduleren, blijft onechte bloeding een groot probleem bij deze therapieën, waardoor de doseringen en combinaties van deze geneesmiddelen moeten worden verfijnd. Er is dus nog steeds een dringende behoefte om nieuwe antitrombotische geneesmiddelen te ontdekken7.
Trombose wordt bestudeerd met behulp van meerdere methoden om vasculair letsel toe te brengen: mechanisch (vaatligatie), thermisch (laserletsel) en chemisch letsel (FeCl3 / Rose Bengal-toepassing). De aard van trombose varieert afhankelijk van de locatie (arteriële versus veneuze), methode of omvang van het letsel. Van al deze typen is FeCl 3-geïnduceerd vaatletsel de meest gebruikte methode. Het is gebruikt bij muizen, ratten, konijnen, cavia’s en honden 8,9,10,11,12. De methode is relatief eenvoudig, gemakkelijk te gebruiken en als de belangrijkste parameters gestandaardiseerd zijn, is deze gevoelig en reproduceerbaar in verschillende vasculaire systemen (bijv. Slagaders [halsslagader en femoraal], aderen [jugular] en arteriolen [cremaster en mesenterium]) (aanvullende tabel 1).
Dit model kan ook worden gebruikt om ons begrip van de mechanica en morfologie van stolselvorming te vergroten. Deze techniek biedt op unieke wijze het voordeel van het stoppen van trombose op verschillende stroomsnelheidspunten, om de tussenliggende stadia van het proces te bestuderen voordat het occlusief wordt. Recente ontwikkelingen in tromboseonderzoek hebben dit model gebruikt om de aandacht te vestigen op niet-farmacologische methoden van trombolyse13 of niet-invasieve toediening van antitrombotische en / of fibrinolytische middelen14,15. Verschillende groepen hebben aangetoond dat, wanneer bloedplaatjesmembranen zijn bedekt met deze therapeutica, de geneesmiddelen kunnen worden geactiveerd bij thermische stimulatie om stolsels aan te pakken16. De hier beschreven technieken kunnen nuttig zijn voor dergelijke studies als validatie van hun bevindingen op het niveau van enkele bloedplaatjes. In dit manuscript beschrijft Protocol 1 de basis FeCl 3-gemedieerde vasculaire letselprocedure, terwijl Protocol 2 de methode beschrijft om het vasculaire letselmonster te verzamelen en te fixeren voor verdere analyse door elektronenmicroscopie.
De topische toepassing van FeCl3 op de vasculatuur om trombose te induceren is een veel gebruikte techniek en heeft een belangrijke rol gespeeld bij het vaststellen van rollen voor verschillende bloedplaatjesreceptoren, ligandsignaleringsroutes en hun remmers20,21,22,23. Het mechanisme waardoor FeCl3 trombose veroorzaakt is veelzijdig; Eerder werd endotheeldenudatie bescho…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken de leden van het Whiteheart Laboratory voor hun zorgvuldige inzage van dit manuscript. Het werk werd ondersteund door subsidies van de NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 en HL150818), en een Department of Veterans Affairs Merit Award aan S.W.W., R01 HL 155519 aan B.S., en NIBIB intramurale programmasubsidie aan R.D.L.
0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |