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Medicina

塩化第二鉄誘発動脈血栓症および3D電子顕微鏡分析のためのサンプル収集

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64985
, , , , , , , , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology,University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering,National Institutes of Health

Summary

本プロトコルは、FeCl3媒介傷害を使用して動脈血栓症を誘発する方法、および電子顕微鏡分析のために血栓症の様々な段階で動脈損傷サンプルを収集して調製する方法を記載している。

Abstract

心血管疾患は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。異常な血栓症は、糖尿病や肥満などの全身状態、およびアテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患などの慢性炎症性疾患の一般的な特徴です。血管損傷時には、通常、凝固系、血小板、および内皮が調整された方法で作用し、損傷部位に血餅を形成することによって出血を防ぎます。このプロセスの異常は、過度の出血または制御不能な血栓症/不十分な抗血栓活性のいずれかを引き起こし、血管閉塞とその後遺症につながります。FeCl3誘発頸動脈損傷モデルは、血栓症が in vivoでどのように開始および進行するかを調べる上で貴重なツールです。このモデルには、内皮の損傷/露出とそれに続く損傷部位での血餅形成が含まれます。これは、さまざまな程度の血管損傷に応答して血管損傷と血餅形成を監視するための高感度で定量的なアッセイを提供します。最適化されると、この標準的な手法を使用して、血栓症の根底にある分子メカニズム、および成長する血栓における血小板の微細構造変化を研究することができます。このアッセイは、抗血栓薬および抗血小板薬の有効性を研究するのにも有用である。この記事では、FeCl3誘発動脈血栓症を開始および監視する方法、および電子顕微鏡による分析のためにサンプルを収集する方法について説明します。

Introduction

血栓症は、血管を部分的または完全に遮断し、血液の自然な流れを妨げる血栓の形成です。これは、虚血性心疾患や脳卒中などの重度で致命的な心血管イベントにつながります。心血管疾患は罹患率と死亡率の主な原因であり、世界中で4人に1人が死亡しています1,2,3。血栓症は血管系の機能不全として現れますが、根本的な微生物またはウイルス感染、免疫障害、悪性腫瘍、または代謝状態の結果である可能性があります。血流は、内皮細胞、赤血球/白血球、血小板、凝固因子など、血管系の多様な構成要素間の複雑な相互作用によって維持されています4。血管損傷を受けると、血小板は内皮下マトリックス上の接着タンパク質と相互作用し、それらの顆粒内容物を放出し、より多くの血小板を動員します5。同時に、凝固カスケードが活性化され、フィブリンの形成と沈着につながります。最終的に、血餅が形成され、フィブリンメッシュ6内に閉じ込められた血小板および赤血球を含む。血栓症を調節するために抗血小板薬と抗凝固薬が利用可能であるが、偽の出血は依然としてこれらの治療法の主要な懸念事項であり、これらの薬の投与量と組み合わせの微調整が必要である。したがって、新しい抗血栓薬を発見することが依然として緊急に必要です7。

血栓症は、血管損傷を与えるために複数の方法を使用して研究されています:機械的(血管結紮)、熱的(レーザー損傷)、および化学的損傷(FeCl3 /ローズベンガルアプリケーション)。血栓症の性質は、損傷の場所(動脈対静脈)、方法、または程度によって異なります。これらすべてのタイプの中で、FeCl3誘発血管損傷が最も広く使用されている方法です。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ8、9、10、11、12に採用されています。この方法は比較的簡単で使いやすく、主要なパラメータが標準化されていれば、さまざまな血管系(動脈[頸動脈および大腿骨]、静脈[頸静脈]、細動脈[火葬場および腸間膜]など)で感度と再現性があります(補足表1)。

このモデルは、血餅形成の力学と形態の理解を深めるためにも使用できます。この技術は、血栓症が閉塞する前にプロセスの中間段階を研究するために、さまざまな流速ポイントで血栓症を止めるという独自の利点を提供します。血栓症研究における最近の進歩は、このモデルを使用して、血栓溶解の非薬理学的方法13または抗血栓薬および/または線維素溶解剤の非侵襲的送達に注意を向けている14,15。いくつかのグループは、血小板膜がこれらの治療薬でコーティングされている場合、標的凝血塊への熱刺激により薬物を活性化できることを示した16。ここで説明する手法は、単一血小板レベルでの所見の検証などの研究に役立ちます。この原稿では、プロトコル1は基本的なFeCl3媒介血管損傷手順を説明し、プロトコル2は電子顕微鏡によるさらなる分析のために血管損傷サンプルを収集して固定する方法を説明しています。

Protocol

ここで議論されているすべての実験は、ケンタッキー大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されました。 注意: 手術器具は 、図1 と 材料表に記載されています。C57BL / 6Jマウス、8〜10週齢、雄/雌または関連する遺伝子操作(ノックアウトまたはノックイン)株を使用した。 1. FeCl3<…

Representative Results

データは一般に、閉塞までの時間、または完全に閉塞性の血栓を形成するのに必要な時間として提示されます。これらのデータは、Kaplan-Meier生存曲線(図4A)19、血流の停止時または実験終了時の終末血流を示すバー付きのドットプロット(図4B)、または折れ線グラフ(図4C)としてプロットできます。血栓安定性?…

Discussion

血栓症を誘発するための血管系へのFeCl3の局所適用は広く使用されている技術であり、さまざまな血小板受容体、リガンドシグナル伝達経路、およびそれらの阻害剤の役割を確立するのに役立ちました20、21、22、23。FeCl3が血栓症を引き起こすメカニズムは多面的です。以前は、内…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、この原稿を注意深く熟読してくれたホワイトハート研究所のメンバーに感謝します。この作業は、NIH、NHLBI(HL56652、HL138179、およびHL150818)からの助成金、およびSWWへの退役軍人省功労賞、BSへのR01HL 155519、およびR.D.L.へのNIBIB学内プログラム助成金によってサポートされました。

Materials

0.9% Saline  Fisher Scientific  BP358-212 NaCl used to make a solution of 0.9% saline 
1 mL Syringe  Becton, Dickinson and Company  309659
190 Proof Ethanol  KOPTEC V1101  Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery 
2,2,2 Tribromoethanol Sigma Aldrich 48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) DEKNATEL 136082-1204
26G x 3/8 Needle  Becton, Dickinson and Company  305110
2-methyl-2-butanol Sigma Aldrich 240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL Globe Scientific Inc. 135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) Medline MDS090735
Araldite GY 502  Electron microscopy Services  10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm  Corning Incorporated  430165
Compact Scale  Ward's Science  470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long World Precision Instrument 15922-G
DMP-30 activator  Electron microscopy Services  13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA Electron microscopy Services  13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag Crown Products  PP-RB-200
Doppler FlowProbe Transonic Systems Inc. MA0.5PSB
EMBED 812 resin  Electron microscopy Services  14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof  Electron microscopy Services  15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips Integra Miltex 18-784
Filter Paper  VWR 28310-106
Fine Scissors – Sharp-Blunt Fine Science Tools  14028-10
Finger Loop Ear Punches  Fine Science Tools  24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply  Dukal Corporation 2128
Glutaraldehyde (10% solution) Electron microscopy Services  16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 Integra® Miltex® 4110
Iron (III) Chloride  SIGMA-ALDRICH 157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 Integra Lifesciences  157510
L-aspartic acid Sigma Fisher  A93100
L-aspartic acid Fisher Scientific  BP374-100
Lead Nitrate  Fisher Scientific  L-62
LEICA S8AP0 Microscope LEICA No longer available No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand  LEICA 10447255 No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers  VWR 82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical Instrument Company RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution  Electron microscopy Services  19150
Paraformaldehyde (16% solution) Electron microscopy Services  15710
Potassium ferricyanide SIGMA-ALDRICH P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent  Electron microscopy Services  20401
Rainin Classic Pipette PR-10 Rainin 17008649
Research Flowmeter  Transonic Systems Inc. T402B01481 Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear Scotch  305289
Small Animal Heated Pad K&H Manufacturing Inc. Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 Electron microscopy Services  11623
Sterile Cotton Tipped Applicators  Puritan Medical Products  25-806 1WC
Steromaster Illuminator  Fisher Scientific  12-562-21 No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps  Fine Science Tools  11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH) SIGMA-ALDRICH 88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) VWR 76323-394
Uranyl Acetate Electron microscopy Services  22400
Veet Gel Cream Hair Remover Reckitt Benckiser 3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm Fisher Scientific  S38975
WinDAQ/100 Software for Windows DATAQ Instruments, Inc. Version 3.38 Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1 ZEISS 57615
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

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Keywords: Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis3D Electron Microscopy AnalysisPlateletsHemostatic SystemThrombosisCarotid ArteryIron Chloride InjuryFlow MeasurementsFixativeElectron MicroscopyBlood Flow
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Joshi, S., Smith, A. N., Prakhya, K. S., Alfar, H. R., Lykins, J., Zhang, M., Pokrovskaya, I., Aronova, M., Leapman, R. D., Storrie, B., Whiteheart, S. W. Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis. J. Vis. Exp. (193), e64985, doi:10.3791/64985 (2023).
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