يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إصابة بوساطة FeCl3 للحث على تجلط الدم الشرياني ، وكيفية جمع وإعداد عينات إصابة الشرايين في مراحل مختلفة من تجلط الدم لتحليل المجهر الإلكتروني.
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم. تجلط الدم الشاذ هو سمة شائعة للحالات الجهازية مثل مرض السكري والسمنة ، والأمراض الالتهابية المزمنة مثل تصلب الشرايين والسرطان وأمراض المناعة الذاتية. عند إصابة الأوعية الدموية ، عادة ما يعمل نظام التخثر والصفائح الدموية والبطانة بطريقة منسقة لمنع النزيف عن طريق تكوين جلطة في موقع الإصابة. تؤدي التشوهات في هذه العملية إما إلى نزيف مفرط أو تجلط غير منضبط / نشاط مضاد للتخثر غير كاف ، مما يترجم إلى انسداد الأوعية الدموية وعواقبها. يعد نموذج إصابة الشريان السباتي الناجم عن FeCl3 أداة قيمة في التحقق من كيفية بدء تجلط الدم وتقدمه في الجسم الحي. يتضمن هذا النموذج تلفا / تعرية بطانية وتشكيل جلطة لاحقة في الموقع المصاب. يوفر مقايسة كمية حساسة للغاية لمراقبة تلف الأوعية الدموية وتكوين الجلطات استجابة لدرجات مختلفة من تلف الأوعية الدموية. بمجرد تحسينها ، يمكن استخدام هذه التقنية القياسية لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجلط الدم ، وكذلك التغيرات الهيكلية في الصفائح الدموية في الخثرة المتنامية. هذا الفحص مفيد أيضا لدراسة فعالية العوامل المضادة للتخثر والمضادة للصفيحات. تشرح هذه المقالة كيفية بدء ومراقبة تجلط الدم الشرياني الناجم عن FeCl3 وكيفية جمع العينات لتحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني.
تجلط الدم هو تكوين جلطة دموية تسد الأوعية الدموية جزئيا أو كليا ، مما يعوق التدفق الطبيعي للدم. هذا يؤدي إلى أحداث القلب والأوعية الدموية الشديدة والمميتة ، مثل أمراض القلب الإقفارية والسكتات الدماغية. أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات ، وتسبب واحدة من كل أربع وفيات في جميع أنحاء العالم1،2،3. على الرغم من أن تجلط الدم يتجلى كخلل في نظام الأوعية الدموية ، إلا أنه قد يكون نتيجة لعدوى ميكروبية أو فيروسية كامنة أو اضطراب مناعي أو ورم خبيث أو حالة استقلابية. يتم الحفاظ على تدفق الدم من خلال التفاعل المعقد بين المكونات المتنوعة لنظام الأوعية الدموية ، بما في ذلك الخلايا البطانية وخلايا الدم الحمراء / البيضاء والصفائح الدموية وعوامل التخثر4. عند إصابة الأوعية الدموية ، تتفاعل الصفائح الدموية مع البروتينات اللاصقة على المصفوفة تحت البطانية وتطلق محتوياتها الحبيبية ، والتي تجند المزيد من الصفائح الدموية5. في الوقت نفسه ، يتم تنشيط سلسلة التخثر ، مما يؤدي إلى تكوين الفيبرين وترسبه. في النهاية ، يتم تشكيل جلطة تحتوي على الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء المحاصرة داخل شبكة الفيبرين6. على الرغم من توفر الأدوية المضادة للصفيحات ومضادات التخثر لتعديل تجلط الدم ، إلا أن النزيف الزائف لا يزال مصدر قلق كبير مع هذه العلاجات ، مما يتطلب ضبطا دقيقا لجرعات ومجموعات هذه الأدوية. وبالتالي ، لا تزال هناك حاجة ملحة لاكتشاف أدوية جديدة مضادة للتخثر7.
تمت دراسة تجلط الدم باستخدام طرق متعددة لإلحاق إصابة الأوعية الدموية: الميكانيكية (ربط الأوعية) ، الحرارية (إصابة الليزر) ، والإصابة الكيميائية (FeCl3 / تطبيق روز البنغال). تختلف طبيعة الجلطة اعتمادا على الموقع (الشرياني مقابل الوريدي) أو الطريقة أو مدى الإصابة. من بين كل هذه الأنواع ، تعد إصابة الأوعية الدموية التي يسببها FeCl3 هي الطريقة الأكثر استخداما. تم استخدامه في الفئران والجرذان والأرانب وخنازير غينيا والكلاب8،9،10،11،12. هذه الطريقة بسيطة نسبيا وسهلة الاستخدام ، وإذا تم توحيد المعلمات الرئيسية ، فهي حساسة وقابلة للتكرار في أنظمة الأوعية الدموية المختلفة (على سبيل المثال ، الشرايين [السباتي والفخذ] والأوردة [الوداجي] والشرايين [المشمرة والمساريقية]) (الجدول التكميلي 1).
يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لتعزيز فهمنا لميكانيكا ومورفولوجيا تكوين الجلطات. توفر هذه التقنية بشكل فريد ميزة إيقاف تجلط الدم عند نقاط معدل التدفق المختلفة ، لدراسة المراحل المتوسطة من العملية قبل أن تصبح انسدادية. استخدمت التطورات الحديثة في أبحاث تجلط الدم هذا النموذج لتركيز الانتباه على الطرق غير الدوائية لانحلال الخثرة13 أو التوصيل غير الجراحي للعوامل المضادة للتخثر و / أو تحلل الفيبرين14،15. أظهرت عدة مجموعات أنه عندما يتم طلاء أغشية الصفائح الدموية بهذه العلاجات ، يمكن تنشيط الأدوية عند التحفيز الحراري لاستهداف الجلطات16. يمكن أن تكون التقنيات الموضحة هنا مفيدة لدراسات مثل التحقق من صحة نتائجها على مستوى الصفائح الدموية المفردة. في هذه المخطوطة ، يصف البروتوكول 1 الإجراء الأساسي لإصابة الأوعية الدموية بوساطة FeCl3 ، بينما يصف البروتوكول 2 طريقة جمع عينة إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها لمزيد من التحليل بواسطة المجهر الإلكتروني.
التطبيق الموضعي ل FeCl3 على الأوعية الدموية للحث على تجلط الدم هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع ، وكان له دور فعال في إنشاء أدوار لمستقبلات الصفائح الدموية المختلفة ، ومسارات إشارات الرباط ، ومثبطاتها20،21،22،23. الآلية …
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر وايت هارت على اطلاعهم الدقيق على هذه المخطوطة. تم دعم العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، NHLBI (HL56652 ، HL138179 ، و HL150818) ، وجائزة الاستحقاق من وزارة شؤون المحاربين القدامى إلى S.W.W. ، R01 HL 155519 إلى BS ، ومنحة برنامج NIBIB الداخلي إلى R.D.L.
0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |