Summary
Настоящий протокол описывает, как использовать FeCl-3-опосредованное повреждение для индукции артериального тромбоза, а также как собирать и подготавливать образцы артериального повреждения на различных стадиях тромбоза для анализа электронной микроскопии.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Аберрантный тромбоз является общей чертой системных состояний, таких как диабет и ожирение, а также хронических воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз, рак и аутоиммунные заболевания. При повреждении сосудов обычно свертывающая система, тромбоциты и эндотелий действуют организованно, чтобы предотвратить кровотечение, образуя сгусток в месте повреждения. Аномалии в этом процессе приводят либо к чрезмерному кровотечению, либо к неконтролируемому тромбозу / недостаточной антитромботической активности, что приводит к окклюзии сосудов и ее последствиям. Модель повреждения сонной артерии, индуцированная FeCl3, является ценным инструментом для исследования того, как тромбоз инициируется и прогрессирует in vivo. Эта модель включает повреждение / денудацию эндотелия и последующее образование сгустка в поврежденном месте. Он обеспечивает высокочувствительный количественный анализ для мониторинга повреждения сосудов и образования сгустков в ответ на различные степени повреждения сосудов. После оптимизации этот стандартный метод может быть использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе тромбоза, а также ультраструктурных изменений тромбоцитов в растущем тромбе. Этот анализ также полезен для изучения эффективности антитромботических и антиагрегантных средств. В этой статье объясняется, как инициировать и контролировать FeCl-3-индуцированный артериальный тромбоз и как собирать образцы для анализа с помощью электронной микроскопии.
Introduction
Тромбоз - это образование сгустка крови, который частично или полностью блокирует кровеносный сосуд, препятствуя естественному току крови. Это приводит к тяжелым и смертельным сердечно-сосудистым событиям, таким как ишемическая болезнь сердца и инсульты. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности и являются причиной каждой четвертой смерти во всем мире 1,2,3. Хотя тромбоз проявляется как нарушение работы сосудистой системы, он может быть результатом основной микробной или вирусной инфекции, иммунного расстройства, злокачественных новообразований или метаболического состояния. Кровоток поддерживается сложным взаимодействием между различными компонентами сосудистой системы, включая эндотелиальные клетки, эритроциты/лейкоциты, тромбоциты и факторы свертываниякрови 4. При повреждении сосудов тромбоциты взаимодействуют с адгезивными белками на субэндотелиальном матриксе и высвобождают свое зернистое содержимое, которое набирает больше тромбоцитов5. Одновременно активируется каскад коагуляции, что приводит к образованию и отложению фибрина. В конечном итоге образуется сгусток, содержащий тромбоциты и эритроциты, попавшие в фибриновую сетку6. Хотя антиагреганты и антикоагулянты доступны для модуляции тромбоза, ложные кровотечения остаются серьезной проблемой при этих методах лечения, требуя точной настройки дозировок и комбинаций этих препаратов. Таким образом, по-прежнему существует острая необходимость в открытии новых антитромботическихпрепаратов7.
Тромбоз изучается с использованием нескольких методов нанесения сосудистого повреждения: механического (перевязка сосудов), термического (лазерная травма) и химического повреждения (применение FeCl3 / Rose Bengal). Характер тромбоза варьируется в зависимости от локализации (артериальная или венозная), метода или степени повреждения. Среди всех этих типов FeCl-3-индуцированное повреждение сосудов является наиболее широко используемым методом. Он использовался у мышей, крыс, кроликов, морских свинок и собак 8,9,10,11,12. Метод относительно прост, удобен в использовании, и если основные параметры стандартизированы, он чувствителен и воспроизводим в различных сосудистых системах (например, артериях [сонных и бедренных], венах [яремных] и артериолах [кремастерных и брыжеечных]) (Дополнительная таблица 1).
Эта модель также может быть использована для дальнейшего понимания механики и морфологии образования сгустков. Этот метод однозначно предлагает преимущество остановки тромбоза в различных точках скорости потока, чтобы изучить промежуточные стадии процесса, прежде чем он станет окклюзионным. Последние достижения в исследованиях тромбоза использовали эту модель, чтобы сосредоточить внимание на нефармакологических методах тромболизиса13 или неинвазивной доставки антитромботических и/или фибринолитических агентов14,15. Несколько групп показали, что, когда мембраны тромбоцитов покрыты этими терапевтическими средствами, лекарства могут быть активированы при термической стимуляции для воздействия на сгустки16. Описанные здесь методы могут быть полезны для таких исследований, как подтверждение их результатов на уровне отдельных тромбоцитов. В этой рукописи Протокол 1 описывает базовую процедуру повреждения сосудов, опосредованную FeCl3, в то время как Протокол 2 описывает метод сбора и фиксации образца сосудистого повреждения для дальнейшего анализа с помощью электронной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, обсуждаемые здесь, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты перечислены на рисунке 1 и в таблице материалов. Использовали мышей C57BL/6J в возрасте 8-10 недель, самцов/самок или соответствующие генетически модифицированные (нокаутные или нокаутные) штаммы.
1. FeCl3-индуцированное повреждение сонной артерии
- Индукция анестезии мыши
- Взвесьте мышь.
- Обезболивают мышей, вводя 0,2 г/кг раствора трибромэтанола внутрибрюшинно (внутривенно). Перед введением убедитесь, что раствор анестетика имеет комнатную температуру (ЛТ). Этой дозы достаточно, чтобы успокоить мышь примерно на 1 ч.
- Проверьте рефлекс пальца ноги, ущипнув палец через 5 минут после инъекции, чтобы убедиться, что мышь успокоена. Если мышь не успокоена, она отдернет палец ноги. Если это произойдет, подождите 5 минут и проверьте еще раз.
- Если мышь все еще не полностью успокоена, введите 1/4 начальной дозы и подождите 5 минут.
- На протяжении всей процедуры периодически контролируйте плоскость анестетика мыши с помощью защемления пальца ноги. Кроме того, частота дыхания и температура тела также могут контролироваться для поддержания оптимальной анестезии.
- Обездвижить мышь
- Положите мышь на грелку (37 °C) в положении лежа на спине и с помощью клейкой ленты обездвижите конечности.
- Используйте хирургическую нить (0,1 мм), чтобы осторожно потянуть за верхние передние зубы мыши, чтобы расширить область шейки матки / шеи. Это важно для лучшей визуализации операционной области и стабильности допплеровского зонда. Размер нити не важен, так как она используется только для вытягивания передних зубов животного для удлинения шеи.
- Надрез
- Опрыскайте операционную область 70% этанолом или протрите спиртовой салфеткой.
- С помощью ватного тампона нанесите небольшое количество крема для удаления волос на операционную область. Подождите 1-2 минуты, а затем используйте влажное бумажное полотенце или салфетку, чтобы удалить крем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для чистой хирургической области. - С помощью ножниц и щипцов (рис. 1В11,1В13) сделайте срединный разрез от нижней челюсти до надгрудинной выемки. Втяните кожу, чтобы получить лучшую визуализацию области (рис. 2A).
- Обнажение сонной артерии
- С помощью хирургических щипцов и микрорассекающих щипцов тупого рассекают накладывающуюся поверхностную фасцию и удаляют ее, чтобы обнажить левую сонную артерию (рис. 1B12,1B13). Убедитесь, что на этом этапе вы не используете ножницы, чтобы не повредить другие сосуды в этой области.
- Удалите лишнюю ткань, окружающую сонную артерию. Избегайте чрезмерного рассечения окружающих тканей, так как в этой области находится блуждающий нерв и позвоночная артерия.
- Отделите сонную артерию от окружающих тканей, рассекая ее хирургическими щипцами и щипцами для наложения швов (рис. 1B12,1B15,2C). Следите за тем, чтобы не растягивать и не тянуть артерию, чтобы избежать механического повреждения артерии или окружающей сосудистой сети.
- Поместите кусок пластика под артерию, чтобы отметить место травмы (рис. 2D). Используйте цветной прозрачный лист, чтобы его было легче видеть в операционном поле.
- Размещение датчика расхода
- Поместите допплеровский трансзвуковой проточный зонд в физиологический раствор (0,9% NaCl в dH2O) примерно на 10 минут перед операцией. Вставьте другой конец зонда в насадку расходомера, чтобы облегчить считывание расхода. Подключите расходомер к компьютеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: В промежутках между операциями доплеровский трансзвуковой датчик потока должен находиться в физиологическом растворе. Следите за тем, чтобы зонд был влажным и чистым на протяжении всей процедуры. - Поместите ультразвуковой допплеровский датчик трансзвукового потока вокруг артерии выше по течению от пластика (рис. 2D). Убедитесь, что область держателя сосуда зонда не слишком вытянута (рис. 1C, красная стрелка).
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости поддержите зонд марлевыми подушечками (рис. 1B1), чтобы достичь соответствующей высоты зонда, облегчая оптимальное положение считывания. - Если к этому моменту хирургическая область сухая, добавьте несколько капель физиологического раствора, чтобы сохранить область влажной. Следите за показаниями датчика расхода. Оптимальные показания варьируются для каждого животного и могут составлять от 0,6 до 1,2 мл / мин. Если он менее стабилен или нестабилен, измените положение датчика потока, чтобы получить оптимальные показания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шея мыши не слишком вытянута, а область операции чистая.
- Поместите допплеровский трансзвуковой проточный зонд в физиологический раствор (0,9% NaCl в dH2O) примерно на 10 минут перед операцией. Вставьте другой конец зонда в насадку расходомера, чтобы облегчить считывание расхода. Подключите расходомер к компьютеру.
- Запишите базовый план потока
- После установки зонда следите за кровотоком в течение 2 минут, чтобы убедиться, что поток устойчив. Затем запишите поток в течение 2 минут (рис. 3B) в качестве базового уровня. Подробное описание расходомера см. в Subramaniam et al.17.
- Чтобы записать кровоток, запустите программное обеспечение WinDAQ. Нажмите на опцию «Файл», а затем нажмите « Запись». Создайте новую папку и файл и начните запись. Чтобы остановить запись, нажмите « Стоп» в разделе «Файл».
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение WinDAQ находится в свободном доступе у издателя: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Травма
- Остановите запись потока. Следите за тем, чтобы не изменить положение зонда, чтобы показания оставались постоянными после травмы.
- Тщательно вытрите область салфеткой / бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Даже небольшой объем остаточной жидкости может изменить концентрацию раствора FeCl3, используемого для нанесения сосудистого повреждения. Это приводит к переменным результатам и влияет на воспроизводимость. Когда область полностью высохла, зонд не в состоянии измерить расход. - В пластиковую лодку для взвешивания положите круглую фильтровальную бумагу (диаметр 1 мм, вырезанная ушным перфоратором диаметром 1 мм). Добавьте 1 мкл 6% раствора FeCl3 (приготовленного в dH2O) на фильтровальную бумагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте раствор FeCl3 непосредственно перед использованием фильтровальной бумаги. Слишком раннее замачивание бумаги может привести к испарению раствора FeCl3 и изменению тяжести травмы. - Используя тонкие щипцы, возьмите фильтровальную бумагу и положите ее на артерию выше по течению от зонда, на той части артерии, которая отмечена пластиком (рис. 2D, E). Этот пластик выступает в роли маркера и прокладки. Он отмечает поврежденный участок и предотвращает случайное разбавление FeCl3 , избегая контакта с окружающей влажной областью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фильтровальная бумага прямая, не зажата и не сложена каким-либо иным образом. После размещения на артерии не меняйте положение фильтровальной бумаги; Это изменяет степень травмы. - Поместив фильтровальную бумагу, запустите таймер и запишите кровоток. Через 3 минуты удалите бумагу и добавьте физиологический раствор в место повреждения, чтобы удалить FeCl3 и остановить процесс повреждения. Это также делает область влажной. На этом этапе кровоток должен вернуться к исходному уровню, как это было зафиксировано до травмы.
- Контролируйте и записывайте поток до тех пор, пока он не уменьшится до 10% от исходной записи или не достигнет нуля. Наблюдается устойчивое снижение, как только тромб начинает образовываться в месте повреждения (рис. 3C). Обратите внимание на любые значительные колебания потока в течение этого времени.
- Чтобы изучить стабильность тромба, фиксируйте быстрое увеличение кровотока после каждого значительного и последовательного снижения. Эти события классифицируются как эмболизация из-за нестабильного тромбоза (рис. 4D). После последовательного уменьшения потока оператор может увидеть повреждение артерии в конце эксперимента (рис. 2F, синяя стрелка/пунктирный овал).
- Время окклюзии сосудов определяется как полное прекращение кровотока не менее чем на 1 мин. Запишите время, в которое образуется окклюзионный тромб, о чем свидетельствует нулевое показание или значительное уменьшение потока.
- Завершите эксперимент на 30 минуте. Если тромб не образуется в течение 30 минут после мониторинга, то запишите поток, остановите запись и извлеките зонд.
- Очистите зонд 70% этанолом и щеткой, чтобы удалить остатки ткани/волос или мусора. Полностью высушите зонд, прежде чем помещать его в ящик для хранения. Полностью высушите зонд, прежде чем помещать его в ящик для длительного хранения.
- Усыпить мышь вывихом шейки матки. Поместите тушу в пакет для утилизации туши, помеченный названием лаборатории и датой.
2. Сбор и подготовка образцов для серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM) после повреждения, вызванного FeCl3
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный протокол EM подходит для подготовки образцов для SBF-SEM. Этот метод визуализации предлагает беспрецедентную возможность изучения трехмерной структуры тромбоцитов в сгустке. С помощью этого метода образец визуализируется в виде серии последовательных блочных изображений SEM, генерируемых по мере прохождения образца. Ключевыми моментами для этой подготовки являются: 1) образец должен быть окрашен тяжелыми металлами с предварительным встраиванием; и 2) пластиковый закладной образец должен быть соответствующим образом обрезан для монтажа в СЭМ (см. Рисунок 6 для изображения обрезанных образцов). Окрашивание после встраивания в СЭМ невозможно. При сборе образца из повреждения сосуда, вызванного FeCl3, для ЭМ-анализа необходимо внести следующие изменения во время выполнения операции. Представленные модификации хирургического протокола FeCl3 также применимы к любой форме электронной микроскопии. Условия анестезии и этапы разреза и обнажения сонной артерии такие же, как и в Протоколе 1.
- Обнажив сонную артерию, отметьте место травмы, свободно опоясав область между двумя хирургическими нитями (размер: 0,1 мм) (рис. 5A, B).
- Поместите зонд под артерию, дистальнее нижней нити (рис. 5C).
- Вставьте пластиковую деталь под артерию между двумя нитями, чтобы отметить место повреждения FeCl3 (рис. 5C).
- Перед выполнением травмы проведите измерения потока, чтобы отметить базальный поток. Эти измерения используются для принятия решения о том, на каком этапе будет собираться образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фиксатор (3% параформальдегид / PFA + 0,1% глутаровый альдегид, оба изготовлены в 1x PBS) готов и находится в RT. В качестве альтернативы можно также использовать фиксацию с 2,5% глутарового альдегида на физиологическом фоне.
ВНИМАНИЕ: И параформальдегид, и глутаровый альдегид очень токсичны и раздражают. При обращении с ними следует использовать перчатки, щиток для глаз и маски для защиты от воздействия. Все фиксирующие растворы токсичны, и этапы фиксации следует проводить в вытяжном шкафу. - Выполните травму, поместив пропитанную FeCl 3 фильтровальную бумагу на артерию (используется 8% FeCl 3) на3 минуты (это время также может варьироваться). Через 3 минуты снимите фильтровальную бумагу и добавьте физиологический раствор в место повреждения, чтобы удалить избыток FeCl3. Этот шаг необходим для предотвращения различной степени повреждения и облегчения подсчета потока с помощью зонда (рис. 5D).
- Следите за показаниями расхода. Когда расход упадет ниже 50% от исходного значения, снимите зонд. Быстро высушите область и добавьте фиксатор в область, чтобы внешне зафиксировать область травмы.
- Быстро зажмите артерию рядом с областью травмы щипцами и срежьте вниз по течению от нижней нити и вверх по течению от верхней нити. При необходимости попросите другого человека помочь отрезать один конец. Положите ткань на пластиковую чашку для культивирования ткани в той же ориентации, в которой она была собрана, и добавьте несколько капель фиксатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перерезание артерии вызывает немедленное обширное кровотечение, поэтому обязательно держите артерию, прежде чем перерезать ее в первый раз. В этом случае мышь обескровливается. Мышь усыпляют путем обескровливания и вывиха шейки матки. - С помощью скальпеля очистите лишнюю ткань вокруг артерии. Не забывайте записывать ориентацию кровотока. Чтобы отметить это, отрежьте один конец горизонтально, а другой сужающийся/косой (рис. 5E).
- Держите образец в фиксаторе (3% PFA и 0,1% глутарового альдегида) в течение 1 ч при ЛТ. Затем храните образец в 1% PFA при 4 ° C до отправки его на влажном льду в лабораторию обработки образцов для ЭМ-анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы не должны быть заморожены. Проблемы, связанные с этим методом отбора проб, заключаются в следующем:- Первоначальные показания могут быть неоптимальными или могут колебаться после травмы. Это может повлиять на степень травмы, выбранной для остановки для ЭМ-анализа. Чтобы решить эту проблему, обязательно запишите базовые показания в течение нескольких минут, попробовав различные положения размещения зонда, чтобы решить, какое положение является оптимальным.
- Время, необходимое для купирования травмы путем добавления внешнего фиксатора и фактического разрезания артериального участка для анализа, может добавить вариабельность степени тромбоза. Будьте быстры во время отбора проб после внешней фиксации.
- Получение образцов для обработки для ЭМ-анализа в 1% PFA на влажном льду. Промойте образцы в течение 3 минут на льду с 0,1 М какодилатным буфером, чтобы начать дальнейшую обработку.
- Зафиксируйте образцы на 1 ч на льду в 0,1 М какодилатном буфере + 2,5% глутарового альдегида + 2 мМCaCl2.
- Выбросьте фиксатор и промойте образцы холодным 0,1 М буфером какодилата натрия, содержащим 2 мМ CaCl2 (5 x 3 мин) (рис. 6А).
- Зафиксировать образцы раствором осмия (3% ферроцианид калия [K 4 C 6 N6Fe] + 0,3 М какодилатный буфер + 4 мМ CaCl 2, смешанный с равным объемом 4% водного тетраоксида осмия [OsO4; в ddH2 O]) в течение 1 ч на льду.
- Пока образцы фиксируются, сделайте свежий 1% раствор гидрата трихлорацетальдегида (TCH) в ddH2O. Инкубируйте раствор при 60 ° C в течение 1 ч, осторожно перемешивая.
- После фиксации промойте образцы ddH2O при RT в течение 5 x 3 мин.
- Инкубируют образцы в отфильтрованном 1% растворе TCH (изготовленном в ddH2O) в течение 20 мин при РТ.
- Промойте образцы ddH2O при RT (5 x 3 мин).
- Зафиксируйте образцы в 2% тетраоксиде осмия в ddH2O в течение 30 мин при ЛТ.
- Промойте образцы ddH2O при RT в течение 5 x 3 мин каждый.
- Поместите образцы в 1% уранилацетат (водный) и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 ° C.
- Промойте образцы ddH2O при RT в течение 5 x 3 мин каждый и обработайте их с помощью окрашивания аспартатом свинца по Уолтону.
- Монолитный Окрашивание свинцовым аспартатом Уолтона3:
- Сделайте 30 мМ раствора L-аспарагиновой кислоты в ddH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аспарагиновая кислота растворяется быстрее, если рН повышен до 3,8. Этот стоковый раствор стабилен в течение 1-2 месяцев при хранении в холодильнике. - Сделайте 20 мМ раствора нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты и отрегулируйте рН до 5,5 с помощью 1 N KOH.
- Поместите образцы в раствор аспартата свинца при 60 ° C на 30 мин, после пяти промывок ddH2O при RT, каждая в течение 3 мин.
- Сделайте 30 мМ раствора L-аспарагиновой кислоты в ddH2O.
- Обезвоживайте образцы с помощью градуированной серии этанола. Используйте химическое обезвоживание по протоколуВальдивии 18.
- Промойте образцы в каждом из следующих растворов, чтобы постепенно обезвоживать образец (рис. 6B):
25% этиловый спирт в течение 3 мин
50% этиловый спирт в течение 3 мин
75% этиловый спирт в течение 3 мин
95% этиловый спирт в течение 3 мин
100% этиловый спирт в течение 10 минут и повторите шаг дважды (всего три стирки).
- Промойте образцы в каждом из следующих растворов, чтобы постепенно обезвоживать образец (рис. 6B):
- Промойте образцы в 100% оксиде пропилена (PO) в течение 10 минут и повторите этот шаг дважды (всего три стирки).
- Инкубируйте в 50%/50% PO/смоле с активатором DMP 30 в течение ночи при RT и встраивайте в 100% Araldite 502/embed 812/DDSA с активатором DMP30 в течение 48 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные обычно представляются как время до окклюзии или время, необходимое для формирования полностью окклюзионного тромба. Эти данные могут быть построены в виде кривой выживаемости Каплана-Мейера (рис. 4A)19, точечной диаграммы с полосами, показывающими конечный кровоток в момент прекращения кровотока или завершения эксперимента (рис. 4B), или в виде линейного графика (рис. 4C). Стабильность тромба можно изучить с помощью этой методики. В большинстве случаев при повреждении FeCl3 тромб образуется постепенно, а по мере роста кровоток постепенно уменьшается, достигая нуля при полной окклюзии сосуда. В некоторых случаях кровоток внезапно увеличивается после постепенного уменьшения в течение нескольких минут. Это интерпретируется как частичное выделение растущего тромба и может рассматриваться как событие эмболизации (рис. 4D). Морфология окклюзионного тромба (рис. 7А) также может быть изучена с помощью этого метода.
Таблица 1: Потенциальные технические проблемы в модели и решениях FeCl-3-индуцированного тромбоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1: Хирургические инструменты, необходимые для выполнения FeCl-3-индуцированного тромбоза сонной артерии у мышей. (A) 1: Микроскоп LEICA S8AP0 и подставка. 2: Прокладка с подогревом для мелких животных, покрытая алюминиевой фольгой. (B) 1: Марлевые губки. 2: 26 G x 3/8 иглы. 3: шприц 1 мл. 4: Стерильные аппликаторы с ватными наконечниками. 5: Черный плетеный шелковый шов. 6: Хирургическое лезвие. 7: Ручка ножа из нержавеющей стали. 8: Коммерческий крем для удаления волос. 9: Удар в уши. 10: Рассекающие ножницы. 11: Тонкие ножницы. 12: Хирургические щипцы. 13: Микрорассекающие щипцы. 14: Щипцы для глаз. 15: Щипцы для наложения швов. (C) Трансзвуковой датчик потока с гибкой областью (красная стрелка) и выемкой, удерживающей сосуд (черная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Хирургические шаги по подготовке сонной артерии к травме и измерению окклюзии сосудов. Используя ножницы и хирургические щипцы, сделайте срединный разрез и осторожно оттяните ткань (A), чтобы обнажить сонную артерию под ней (B). Черная стрелка показывает направление кровотока (B). Очистите окружающие ткани, окружающие сонную артерию (C), и поместите кусок пластиковой бумаги (желтый пластик показан черной стрелкой) и зонд (D). Повредите сосуд, поместив пропитанную FeCl3 фильтровальную бумагу (показана красной стрелкой) на артерию (E). Снимите бумагу и следите за травмой. В конце травма видна в виде желто-белой полосы, обозначенной синим наконечником стрелки (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Считывание кровотока с помощью расходомера. Кровоток в сонной артерии измеряется с помощью флоуметра (А). Поток записывается с помощью функции записи на вкладке файла (B). Исходный поток должен быть относительно постоянным до проведения травмы (около 0,8 мл / мин, показанный черной стрелкой) (B). После травмы кровоток уменьшается равномерно (примерно на 50% меньше исходного значения, около 0,4 мл / мин), что показано черной стрелкой (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные представления данных из модели повреждения сонной артерии, вызванной FeCl3. Показаны различные методы, доступные для представления данных о FeCl3-индуцированном повреждении сосудов. Кривые выживаемости Каплана-Мейера показывают время до окклюзии для каждой мыши. Логарифмический тест выполняется для статистического анализа. p ≤ 0,001 (А). Кровоток в конце эксперимента также может быть представлен в виде гистограммы (B). Для данных, представленных в B, был выполнен непарный t-критерий *** p ≤ 0,001. Полоса ошибок представляет собой среднее значение ± SD. Данные о доплеровском потоке, собранные после травмы у одного животного, могут быть представлены в виде линейного графика (C). Пример потенциального события эмболизации при внезапном увеличении кровотока после устойчивого постепенного снижения кровотока у одной мыши в различные моменты времени (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Коллекция FeCl-3-индуцированных травмирующих сгустков для исследований электронной микроскопии. Обнажив артерию (А), отметьте место повреждения, слабо связав нити (В), и поместите пластиковую бумагу под артерию и зонд ниже по течению от нее (С). Выполняйте травму и следите за повреждением (D). Соберите ткань, как описано в тексте, очистите и разрежьте образец прямо с одной стороны и косой с другой стороны, чтобы показать направление кровотока (черная стрелка показывает направление кровотока, а красный контур указывает на поврежденную область) (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Постфиксационная обработка и монтаж образцов для электронной микроскопии. Образцы промывают в микроцентрифужных пробирках между стадиями обработки (А) и последовательно обезвоживают с повышенной концентрацией этанола (В). После обработки их встраивают в смолу (С), а блоки маркируют направлением кровотока (D), а затем разрезают на ломтики для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Репрезентативные электронные микрофотографии проксимальных и дистальных областей полностью окклюзионного тромба после FeCl-3-опосредованного повреждения сонной артерии. (A) Полный поперечный срез закупоренной артерии, проксимальный месту повреждения, со вставками внизу, показывающими структуры с большим увеличением (a: 2x и a': 4x). Поврежденная область обозначена стрелкой в A. Масштабная линейка: 100 мкм. (B) Полный поперечный срез закупоренной артерии, дистальнее места повреждения, со вставками внизу, показывающими структуры с большим увеличением (b: 2x и b': 4x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Краткий обзор вариаций на животных моделях, места повреждения FeCl3 , концентрации FeCl3 , метода травмы и времени тромбоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Местное применение FeCl3 в сосудистой сети для индукции тромбоза является широко используемым методом и играет важную роль в установлении ролей различных рецепторов тромбоцитов, сигнальных путей лиганда и их ингибиторов20,21,22,23. Механизм, посредством которого FeCl3 вызывает тромбоз, многогранен; Ранее эндотелиальная денудация считалась причиной тромбоза, однако в последние годы в многочисленных отчетах была высказана мысль о роли эритроцитов и белков плазмы в этом процессе24,25,26,27.
Наиболее важными шагами в этом протоколе являются: размещение доплеровского зонда для получения оптимального потока, размещение фильтровальной бумаги и быстрое прекращение повреждения для извлечения и немедленной фиксации образца. Последствия неудач на этих этапах и способы их устранения описаны в таблице 1. Несмотря на простоту и чувствительность, этот метод может быть сложным в использовании, в зависимости от модели животного, происхождения животного, места повреждения сосудов, концентрации FeCl3, метода нанесения FeCl3, продолжительности применения, возраста и пола животного, а также типа используемой анестезии. Эти различия могут объяснять относительно широкий диапазон времени тромбоза у C57BL/6J, о котором сообщается в литературе (Дополнительная таблица 1)27,28,29,30,31,32. Этот протокол предлагает использовать для эксперимента 8-10-недельных мышей, так как размер сосудистой сети легче визуализировать и оперировать. Некоторые группы использовали мышей в возрасте от 6 недельдо 33 лет. Крайне важно сопоставить возраст мышей для последовательного и воспроизводимого сравнения между различными группами животных. Описанная анестезия, трибромэтанол, является предпочтительной, потому что она легко доступна, ее легче вводить, она поддерживает анестезирующую плоскость в течение требуемой продолжительности, а требуемая дозировка воспроизводима. Доступны многие другие варианты анестезии, включая изофлуран и различные комбинации трибромэтанола с третичным амиловым спиртом с ксилазином и/или ацепромазином. Крайне важно использовать оптимальную дозу для достижения седативного эффекта, не оказывая негативного влияния на частоту сердечных сокращений или артериальное давление животного. Использование одного и того же метода анестезии на протяжении всего эксперимента предотвращает потенциальное сложное воздействие на время тромбоза.
В этой рукописи представлена подробная процедура, направленная на минимизацию вариаций данных и повышение воспроизводимости. Приведена таблица для устранения некоторых проблем, которые могут возникнуть во время этой операции (таблица 1). Кроме того, в этой рукописи предлагается метод сбора образцов в конце травмы для изучения структуры и морфологии окклюзионного тромба (рис. 7). Разрешение ЭМ обеспечивает лучшую, чем это было возможно ранее,визуализацию 25 тромбоцитов в растущем томбусе и то, как они взаимодействуют с другими тромбоцитами и эндотелием как проксимальным, так и дистальным отделом сосудистого повреждения. Он также может быть использован для изучения различных стадий активации тромбоцитов в месте повреждения.
Еще одним важным преимуществом этого метода является то, что оператор может использовать базовые показания, чтобы решить, на каком этапе собирается образец тромба. Следует отметить, что это приблизительные сроки и не указывают точную степень травмы/тромбоза. Базальные показания зависят от оптимального размещения зонда, и если они размещены неправильно, показания могут регистрировать только частичный поток. Это приводит к ошибочной интерпретации времени окончания и, следовательно, морфологии собранного образца. Для достижения стабильных и воспроизводимых результатов требуется быстрое прекращение процесса травмы и немедленная фиксация образцов.
В этом протоколе представлены минимально необходимые настройки для оценки окклюзионного тромбоза. Благодаря достижениям в области микроскопии несколько групп использовали этот метод для флуоресцентной маркировки тромбоцитов/эндотелиальных клеток и/или релизата тромбоцитов, таких как PF4 и P-селектин и фибрин, для визуализации специфических аспектов тромбоза in vivo и определения его кинетики34,35. Как описано, приведенный здесь метод может сообщать о событиях эмболизации, которые указывают на нестабильность тромба (рис. 4D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, связанных с данным исследованием.
Профили ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Авторы благодарят сотрудников Лаборатории Уайтхарта за внимательное прочтение этой рукописи. Работа была поддержана грантами от NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 и HL150818), а также премией Департамента по делам ветеранов за заслуги перед S.W.W., R01 HL 155519 B.S. и грантом очной программы NIBIB для R.D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
