Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l’osservazione degli sferoidi e l’analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.
Negli ultimi decenni, oltre alle cellule coltivate monostrato, gli sferoidi tumorali tridimensionali sono stati sviluppati come uno strumento potenzialmente potente per la valutazione dei farmaci antitumorali. Tuttavia, i metodi di coltura convenzionali non hanno la capacità di manipolare gli sferoidi tumorali in modo omogeneo a livello tridimensionale. Per affrontare questa limitazione, in questo articolo, presentiamo un metodo conveniente ed efficace per costruire sferoidi tumorali di medie dimensioni. Inoltre, descriviamo un metodo di analisi basato su immagini utilizzando un software di analisi basato sull’intelligenza artificiale in grado di scansionare l’intera lastra e ottenere dati sugli sferoidi tridimensionali. Sono stati studiati diversi parametri. Utilizzando un metodo standard di costruzione sferoidale tumorale e un sistema di imaging e analisi ad alto rendimento, l’efficacia e l’accuratezza dei test farmacologici eseguiti su sferoidi tridimensionali possono essere notevolmente aumentate.
Il cancro è una delle malattie più temute dagli esseri umani, anche a causa del suo alto tasso di mortalità1. Negli ultimi anni, la possibilità di curare il cancro è aumentata con l’introduzione di nuove terapie 2,3,4,5. I modelli in vitro bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) vengono utilizzati per studiare il cancro in un ambiente di laboratorio. Tuttavia, i modelli 2D non possono valutare immediatamente e accuratamente tutti i parametri importanti che indicano la sensibilità antitumorale; pertanto, non riescono a rappresentare pienamente le interazioni in vivo nei test di terapia farmacologica6.
Dal 2020, il mercato globale della cultura tridimensionale (3D) è stato notevolmente potenziato. Secondo un rapporto del NASDAQ OMX, il valore globale del mercato delle colture cellulari 3D supererà i 2,7 miliardi di dollari entro la fine del 2025. Rispetto ai metodi di coltura 2D, la coltura cellulare 3D presenta proprietà vantaggiose, che possono essere ottimizzate non solo per la proliferazione e la differenziazione, ma anche per la sopravvivenza a lungo termine 7,8. In questo modo, i microambienti cellulari in vivo possono essere simulati per ottenere una caratterizzazione più accurata del tumore, nonché un profilo metabolico, di modo che le alterazioni genomiche e proteiche possano essere meglio comprese. A causa di ciò, i sistemi di test 3D dovrebbero ora essere inclusi nelle operazioni di sviluppo di farmaci tradizionali, in particolare quelli con particolare attenzione allo screening e alla valutazione di nuovi farmaci antitumorali. Le crescite tridimensionali di linee cellulari consolidate immortalizzate o colture cellulari primarie in strutture sferoidi possiedono caratteristiche in vivo di tumori come ipossia e penetrazione di farmaci, nonché interazione, risposta e resistenza cellulare, e possono essere considerate un modello rigoroso e rappresentativo per eseguire lo screening farmacologico in vitro 9,10,11.
Tuttavia, questi modelli di cultura 3D soffrono anche di diversi problemi che potrebbero richiedere del tempo per essere risolti. Gli sferoidi cellulari possono essere formati utilizzando questi protocolli, ma differiscono in alcuni dettagli, come il tempo di coltura o l’incorporazione di gel12, quindi questi sferoidi cellulari costruiti non possono essere ben controllati in un intervallo di dimensioni limitato. La dimensione degli sferoidi può influenzare la coerenza del test di vitalità e dell’analisi di imaging. Anche i microambienti di crescita e i fattori di crescita variano, il che può portare a morfologie diverse a causa delle differenze nella differenziazione tra le cellule13. Ora c’è un’ovvia necessità di un metodo standard, semplice ed economico per la costruzione di tutti i tipi di tumori con dimensioni controllate.
Da un’altra prospettiva, sebbene siano stati sviluppati saggi omogenei e approcci di imaging ad alto contenuto per valutare morfologia, vitalità e tasso di crescita, lo screening ad alto rendimento dei modelli 3D rimane una sfida per vari motivi riportati in letteratura, come la mancanza di uniformità nella posizione, dimensione e morfologia degli sferoidi tumorali14,15,16.
Nel protocollo qui presentato, elenchiamo ogni fase nella costruzione di sferoidi tumorali 3D e descriviamo un metodo per l’osservazione e l’analisi sferoidale utilizzando un sistema di imaging ad alto rendimento e ad alto contenuto che coinvolge auto-focus, auto-imaging e analisi, tra le altre caratteristiche vantaggiose. Mostriamo come questo metodo può produrre sferoidi tumorali 3D di dimensioni uniformi che sono adatti per l’imaging ad alto rendimento. Questi sferoidi dimostrano anche un’elevata sensibilità al trattamento farmacologico del cancro e i cambiamenti morfologici negli sferoidi possono essere monitorati utilizzando l’imaging ad alto contenuto. In sintesi, dimostriamo la robustezza di questa metodologia come mezzo per generare costrutti tumorali 3D per scopi di valutazione dei farmaci.
Il microambiente svolge un ruolo importante nella crescita del tumore. Può influenzare la fornitura di matrici extracellulari, gradienti di ossigeno, nutrizione e interazione meccanica e, quindi, influenzare l’espressione genica, le vie del segnale e molte funzioni delle cellule tumorali 19,20,21. In molti casi, le cellule 2D non producono tali effetti o addirittura producono effetti opposti, influenzando così la valutazione d…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo tutti i membri dei nostri laboratori per il loro contributo critico e suggerimenti. Questa ricerca è stata sostenuta dal Key Project della Jiangsu Commission of Health (K2019030). La concettualizzazione è stata condotta da C.W. e Z.C., la metodologia è stata eseguita da W.H. e M.L., l’indagine è stata eseguita da W.H. e M.L., la cura dei dati è stata eseguita da W.H., Z.Z., S.X. e M.L., la preparazione della bozza originale è stata eseguita da Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., la revisione e l’editing sono stati eseguiti da Z.C., l’amministrazione del progetto è stata eseguita da C.W. e Z.C. e l’acquisizione dei finanziamenti è stata condotta da C.W. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
3D gel | Avatarget | MA02 | |
48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
DMSO | sigma | D2650-100ML | |
Excel sofware | Microsoft office | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
Image J software | National Institutes of Health | ||
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PBS | Solarbio | P1020 | |
Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |