약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성
Summary
이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.
Abstract
최근 수십 년 동안 단층 배양 세포 외에도 3차원 종양 스페로이드가 항암제 평가를 위한 잠재적으로 강력한 도구로 개발되었습니다. 그러나 종래의 배양 방법은 3차원 수준에서 균질한 방식으로 종양 스페로이드를 조작하는 능력이 부족합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 논문에서는 평균 크기의 종양 스페로이드를 구성하는 편리하고 효과적인 방법을 제시합니다. 또한 전체 플레이트를 스캔하고 3차원 스페로이드에 대한 데이터를 얻을 수 있는 인공 지능 기반 분석 소프트웨어를 사용한 이미지 기반 분석 방법에 대해 설명합니다. 몇 가지 매개 변수가 연구되었습니다. 표준 종양 스페로이드 구성 방법과 고처리량 이미징 및 분석 시스템을 사용하면 3차원 스페로이드에서 수행되는 약물 테스트의 효과와 정확성을 크게 높일 수 있습니다.
Introduction
암은 인간이 가장 두려워하는 질병 중 하나이며, 특히 높은 사망률때문에 1. 최근 몇 년 동안 새로운 치료법이 도입됨에 따라 암 치료 가능성이 높아졌습니다 2,3,4,5. 2차원(2D) 및 3차원(3D) 체외 모델은 실험실 환경에서 암을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 2D 모델은 항종양 민감도를 나타내는 모든 중요한 매개변수를 즉각적이고 정확하게 평가할 수 없습니다. 따라서 약물 치료 테스트에서 생체 내 상호작용을 완전히 나타내지 못한다6.
2020년부터 글로벌 3차원(3D) 문화 시장이 크게 성장했습니다. NASDAQ OMX의 한 보고서에 따르면 3D 세포 배양 시장의 글로벌 가치는 2025년 말까지 27억 달러를 초과할 것입니다. 2D 배양 방법과 비교하여 3D 세포 배양은 증식 및 분화뿐만 아니라 장기 생존을 위해 최적화할 수 있는 유리한 특성을 나타냅니다 7,8. 이러한 수단을 통해 생체 내 세포 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 정확한 종양 특성화와 대사 프로파일링을 얻을 수 있으므로 게놈 및 단백질 변화를 더 잘 이해할 수 있습니다. 이로 인해 3D 테스트 시스템은 이제 주류 약물 개발 작업, 특히 새로운 항암제 스크리닝 및 평가에 중점을 둔 작업에 포함되어야 합니다. 스페로이드 구조에서 불멸화된 확립된 세포주 또는 일차 세포 배양의 3차원 성장은 저산소증 및 약물 침투와 같은 종양의 생체 내 특징뿐만 아니라 세포 상호작용, 반응 및 내성을 가지며, 시험관 내 약물 스크리닝을 수행하기 위한 엄격하고 대표적인 모델로 간주될 수 있습니다 9,10,11.
그러나 이러한 3D 배양 모델에는 해결하는 데 시간이 걸릴 수 있는 몇 가지 문제가 있습니다. 세포 스페로이드는 이러한 프로토콜을 사용하여 형성될 수 있지만, 배양 시간 또는 매립 겔(12)과 같은 특정 세부사항에서 상이하므로, 이러한 구성된 세포 스페로이드는 제한된 크기 범위 하에서 잘 제어될 수 없다. 스페로이드의 크기는 생존력 테스트 및 이미징 분석의 일관성에 영향을 미칠 수 있습니다. 성장 미세 환경과 성장 인자 또한 다양하며, 이는 세포 간의 분화의 차이로 인해 다른 형태를 초래할 수 있다13. 이제 제어된 크기로 모든 유형의 종양을 구성하기 위한 표준적이고 간단하며 비용 효율적인 방법이 분명히 필요합니다.
또 다른 관점에서, 형태, 생존력 및 성장률을 평가하기 위해 균질한 분석 및 고함량 이미징 접근법이 개발되었지만, 종양 스페로이드의 위치, 크기 및 형태의 균일성 부족과 같은 문헌에 보고된 다양한 이유로 3D 모델의 고처리량 스크리닝은 여전히 도전 과제로 남아 있습니다14,15,16.
여기에 제시된 프로토콜에서는 3D 종양 스페로이드 구성의 각 단계를 나열하고 다른 유리한 특성 중에서 자동 초점, 자동 이미징 및 분석을 포함하는 고처리량, 고함량 이미징 시스템을 사용하여 스페로이드 관찰 및 분석 방법을 설명합니다. 우리는 이 방법이 어떻게 고처리량 이미징에 적합한 균일한 크기의 3D 종양 스페로이드를 생성할 수 있는지 보여줍니다. 이러한 스페로이드는 또한 암 약물 치료에 대한 높은 민감도를 나타내며 고함량 이미징을 사용하여 스페로이드의 형태학적 변화를 모니터링할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 약물 평가 목적을 위한 3D 종양 구조를 생성하는 수단으로서 이 방법론의 견고성을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미세 환경은 종양 성장에 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 외 기질, 산소 구배, 영양 및 기계적 상호 작용의 제공에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 유전자 발현, 신호 경로 및 종양 세포의 많은 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 19,20,21. 많은 경우에, 2D 세포는 그러한 효과를 내지 못하거나 심지어 반대 효과를 생성하여, 약물 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중요한 의견과 제안을 해주신 모든 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Jiangsu Commission of Health (K2019030)의 핵심 프로젝트에 의해 지원되었습니다. 개념화는 C.W.와 Z.C.에 의해, 방법론은 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 조사는 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 데이터 큐레이션은 W.H., Z.Z., S.X., M.L.에 의해 수행되었고, 원래 초안 준비는 Z.Z., J.Z., S.X., W.H., 및 X.L., 검토 및 편집은 Z.C.에서, 프로젝트 관리는 C.W.와 Z.C.에서, 자금 조달은 C.W.에서 수행했습니다. 모든 저자는 출판된 버전의 원고를 읽고 동의했습니다.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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