İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi
Summary
Bu makalede, üç boyutlu tümör sferoidlerinin oluşturulması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve görüntü tabanlı derin öğrenme analizi için bir strateji de açıklanmaktadır.
Abstract
Son yıllarda, tek katmanlı kültürlü hücrelere ek olarak, üç boyutlu tümör sferoidleri, antikanser ilaçların değerlendirilmesi için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, geleneksel kültür yöntemleri, tümör sferoidlerini üç boyutlu düzeyde homojen bir şekilde manipüle etme yeteneğinden yoksundur. Bu sınırlamayı ele almak için, bu yazıda, ortalama büyüklükteki tümör sferoidlerini oluşturmak için uygun ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, tüm plakayı tarayabilen ve üç boyutlu sferoidler hakkında veri elde edebilen yapay zeka tabanlı analiz yazılımı kullanarak görüntü tabanlı bir analiz yöntemini açıklıyoruz. Çeşitli parametreler üzerinde çalışıldı. Standart bir tümör sferoid yapım yöntemi ve yüksek verimli bir görüntüleme ve analiz sistemi kullanılarak, üç boyutlu sferoidler üzerinde yapılan ilaç testlerinin etkinliği ve doğruluğu önemli ölçüde artırılabilir.
Introduction
Kanser, insanlar tarafından en çok korkulan hastalıklardan biridir, özellikle de yüksek ölüm oranı nedeniyle1. Son yıllarda, yeni tedavilerin tanıtılmasıyla kanseri tedavi etme olasılığı artmıştır 2,3,4,5. İki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) in vitro modeller, kanseri laboratuvar ortamında incelemek için kullanılır. Bununla birlikte, 2D modeller, antitümör duyarlılığını gösteren tüm önemli parametreleri hemen ve doğru bir şekilde değerlendiremez; Bu nedenle, ilaç tedavisi testinde in vivo etkileşimleri tam olarak temsil edemezler6.
2020’den bu yana, küresel üç boyutlu (3D) kültür pazarı büyük ölçüde artırıldı. NASDAQ OMX’in bir raporuna göre, 3D hücre kültürü pazarının küresel değeri 2025 yılı sonuna kadar 2,7 milyar doları aşacak. 2D kültür yöntemleri ile karşılaştırıldığında, 3D hücre kültürü, sadece çoğalma ve farklılaşma için değil, aynı zamanda uzun süreli sağkalım için de optimize edilebilen avantajlı özellikler sergiler 7,8. Bu sayede, genomik ve protein değişikliklerinin daha iyi anlaşılabilmesi için metabolik profillemenin yanı sıra daha doğru tümör karakterizasyonu elde etmek için in vivo hücresel mikro ortamlar simüle edilebilir. Bu nedenle, 3D test sistemleri artık ana akım ilaç geliştirme operasyonlarına, özellikle de yeni antitümör ilaçların taranması ve değerlendirilmesine odaklananlara dahil edilmelidir. Ölümsüzleştirilmiş yerleşik hücre hatlarının veya primer hücre kültürlerinin küresel yapılardaki üç boyutlu büyümeleri, hipoksi ve ilaç penetrasyonu gibi tümörlerin in vivo özelliklerinin yanı sıra hücre etkileşimi, yanıtı ve direncine sahiptir ve in vitro ilaç taraması 9,10,11 gerçekleştirmek için sıkı ve temsili bir model olarak kabul edilebilir.
Bununla birlikte, bu 3D kültür modelleri, çözülmesi biraz zaman alabilecek çeşitli problemlerden de muzdariptir. Hücre sferoidleri bu protokoller kullanılarak oluşturulabilir, ancak kültür zamanı veya jellerin gömülmesi12 gibi belirli ayrıntılarda farklılık gösterirler, bu nedenle bu yapılandırılmış hücre sferoidleri sınırlı bir boyut aralığında iyi kontrol edilemez. Sferoidlerin boyutu, canlılık testinin ve görüntüleme analizinin tutarlılığını etkileyebilir. Büyüme mikro ortamları ve büyüme faktörleri de değişir, bu da hücreler arasındaki farklılaşmadaki farklılıklar nedeniyle farklı morfolojilere yol açabilir13. Artık kontrollü boyutlarda her türlü tümörü oluşturmak için standart, basit ve uygun maliyetli bir yönteme ihtiyaç duyulmaktadır.
Başka bir açıdan bakıldığında, morfolojiyi, canlılığı ve büyüme hızını değerlendirmek için homojen tahliller ve yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımları geliştirilmiş olmasına rağmen, 3D modellerin yüksek verimli taraması, tümör sferoidlerinin pozisyonunda, boyutunda ve morfolojisinde tekdüzelik eksikliği gibi literatürde bildirilen çeşitli nedenlerden dolayı bir zorluk olmaya devam etmektedir14,15,16.
Burada sunulan protokolde, 3D tümör sferoidlerinin yapımındaki her adımı listeliyoruz ve diğer avantajlı özelliklerin yanı sıra otomatik odaklama, otomatik görüntüleme ve analizi içeren yüksek verimli, yüksek içerikli bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve analiz için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntemin, yüksek verimli görüntüleme için uygun olan tek tip boyutta 3D tümör sferoidlerini nasıl üretebileceğini gösteriyoruz. Bu sferoidler ayrıca kanser ilacı tedavisine karşı yüksek duyarlılık gösterir ve sferoidlerdeki morfolojik değişiklikler yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak izlenebilir. Özetle, bu metodolojinin sağlamlığını, ilaç değerlendirme amacıyla 3D tümör yapıları üretmenin bir aracı olarak gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikro çevre tümör büyümesinde önemli bir rol oynar. Hücre dışı matrislerin, oksijen gradyanlarının, beslenmenin ve mekanik etkileşimin sağlanmasını etkileyebilir ve böylece gen ekspresyonunu, sinyal yollarını ve tümör hücrelerinin birçok fonksiyonunu etkileyebilir 19,20,21. Birçok durumda, 2D hücreler bu tür etkiler üretmez, hatta zıt etkiler üretir, bu nedenle ilaç tedavilerinin değerlendirilmesin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvarlarımızın tüm üyelerine eleştirel katkı ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Jiangsu Sağlık Komisyonu Anahtar Projesi (K2019030) tarafından desteklenmiştir. Kavramsallaştırma C.W. ve Z.C. tarafından, metodoloji W.H. ve M.L. tarafından, araştırma W.H. ve M.L. tarafından, veri kürasyonu W.H., Z.Z., S.X. ve M.L. tarafından, orijinal taslak hazırlığı Z.Z., J.Z., S.X., W.H. tarafından gerçekleştirilmiştir. ve X.L., inceleme ve düzenleme Z.C. tarafından, proje yönetimi C.W. ve Z.C. tarafından gerçekleştirilmiş ve finansman alımı C.W. tarafından gerçekleştirilmiştir. Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış versiyonunu okumuş ve kabul etmişlerdir.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
Riferimenti
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
