Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos
Summary
Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.
Abstract
Nas últimas décadas, além das células cultivadas em monocamadas, esferoides tumorais tridimensionais têm sido desenvolvidos como uma ferramenta potencialmente poderosa para a avaliação de drogas antineoplásicas. No entanto, os métodos convencionais de cultura não têm a capacidade de manipular os esferoides tumorais de forma homogênea em nível tridimensional. Para abordar essa limitação, neste artigo, apresentamos um método conveniente e eficaz de construção de esferoides tumorais de tamanho médio. Adicionalmente, descrevemos um método de análise baseado em imagens usando software de análise baseado em inteligência artificial que pode escanear toda a placa e obter dados sobre esferoides tridimensionais. Vários parâmetros foram estudados. Usando um método padrão de construção esferoide tumoral e um sistema de imagem e análise de alto rendimento, a eficácia e a precisão dos testes de drogas realizados em esferoides tridimensionais podem ser dramaticamente aumentadas.
Introduction
O câncer é uma das doenças mais temidas pelo ser humano, principalmente por sua alta taxa demortalidade1. Nos últimos anos, a possibilidade de tratamento do câncer tem aumentado à medida que novas terapias têm sido introduzidas2,3,4,5. Modelos in vitro bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) são usados para estudar o câncer em laboratório. No entanto, os modelos 2D não podem avaliar imediata e precisamente todos os parâmetros importantes que indicam sensibilidade antitumoral; portanto, não conseguem representar completamente as interações in vivo nos testes de terapia medicamentosa6.
Desde 2020, o mercado global de cultura tridimensional (3D) foi muito impulsionado. De acordo com um relatório da NASDAQ OMX, o valor global do mercado de cultura de células 3D excederá US$ 2,7 bilhões até o final de 2025. Comparada aos métodos de cultivo 2D, a cultura de células 3D apresenta propriedades vantajosas, que podem ser otimizadas não só para proliferação e diferenciação, mas também para sobrevivência a longo prazo 7,8. Por esse meio, microambientes celulares in vivo podem ser simulados para obter uma caracterização tumoral mais precisa, bem como o perfil metabólico, para que as alterações genômicas e proteicas possam ser melhor compreendidas. Devido a isso, os sistemas de teste 3D devem agora ser incluídos nas principais operações de desenvolvimento de medicamentos, especialmente aqueles com foco na triagem e avaliação de novas drogas antitumorais. Crescimentos tridimensionais de linhagens celulares estabelecidas imortalizadas ou culturas de células primárias em estruturas esferoides possuem características in vivo de tumores, como hipóxia e penetração de drogas, bem como interação, resposta e resistência celular, e podem ser considerados um modelo rigoroso e representativo para a triagem in vitro de fármacos9,10,11.
No entanto, esses modelos de cultura 3D também sofrem de vários problemas que podem levar algum tempo para serem resolvidos. Os esferoides celulares podem ser formados usando esses protocolos, mas diferem em certos detalhes, como tempo de cultura ou gel de incorporação12, de modo que esses esferoides celulares construídos não podem ser bem controlados sob uma faixa de tamanho restrita. O tamanho dos esferoides pode influenciar a consistência do teste de viabilidade e da análise de imagem. Os microambientes de crescimento e os fatores de crescimento também variam, o que pode levar a diferentes morfologias devido a diferenças na diferenciação entre as células13. Existe agora uma necessidade óbvia de um método padrão, simples e custo-efetivo para a construção de todos os tipos de tumores com tamanhos controlados.
Em outra perspectiva, embora ensaios homogêneos e abordagens de imagem de alto conteúdo tenham sido desenvolvidos para avaliar morfologia, viabilidade e taxa de crescimento, a triagem em larga escala de modelos 3D permanece um desafio por várias razões relatadas na literatura, como a falta de uniformidade na posição, tamanho e morfologia dos esferoides tumorais14,15,16.
No protocolo aqui apresentado, listamos cada etapa da construção de esferoides tumorais 3D e descrevemos um método de observação e análise esferoide usando um sistema de imagem de alto rendimento e alto conteúdo que envolve foco automático, autoimagem e análise, entre outras características vantajosas. Mostramos como este método pode produzir esferoides tumorais 3D de tamanho uniforme que são adequados para imagens de alto rendimento. Esses esferoides também demonstram uma alta sensibilidade ao tratamento medicamentoso do câncer, e alterações morfológicas nos esferoides podem ser monitoradas usando imagens de alto conteúdo. Em resumo, demonstramos a robustez desta metodologia como meio de gerar construtos tumorais 3D para fins de avaliação de fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O microambiente desempenha um papel importante no crescimento tumoral. Pode afetar o fornecimento de matrizes extracelulares, gradientes de oxigênio, nutrição e interação mecânica e, assim, afetar a expressão gênica, as vias de sinal e várias funções das células tumorais19,20,21. Em muitos casos, as células 2D não produzem tais efeitos ou mesmo produzem efeitos opostos, afetando a avaliação dos tratamentos medica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros de nossos laboratórios por suas contribuições críticas e sugestões. Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto Chave da Comissão de Saúde de Jiangsu (K2019030). A conceituação foi conduzida por C.W. e Z.C., a metodologia foi realizada por W.H. e M.L., a investigação foi realizada por W.H. e M.L., a curadoria dos dados foi realizada por W.H., Z.Z., S.X. e M.L., a elaboração do rascunho original foi realizada por Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., a revisão e edição foi realizada por Z.C., a administração do projeto foi realizada por C.W. e Z.C., e a aquisição de financiamento foi conduzida por C.W. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
Riferimenti
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