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Cancer Research

विवो माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन में उपयोग कर दैहिक जीनोम-इंजीनियर माउस मॉडल

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65131
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,3
1Rosalind and Morris Goodman Cancer Research Institute, McGill University, 2Department of Human Genetics, McGill University, 3McGill Integrated Core for Animal Modeling (MICAM), McGill University

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस ओविडक्ट में क्षेत्रीय रूप से प्रतिबंधित सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में वर्णन करता है।

Abstract

जर्मलाइन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जी-जीईएमएम) ने विकास, होमियोस्टैसिस और बीमारी में विवो जीन फ़ंक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, कॉलोनी निर्माण और रखरखाव से जुड़े समय और लागत अधिक हैं। सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन में हालिया प्रगति ने कोशिका / ऊतक / रुचि के अंग को सीधे लक्षित करके दैहिक जीईएमएम (एस-जीईएमएम) की पीढ़ी की अनुमति दी है।

मनुष्यों में ओविडक्ट, या फैलोपियन ट्यूब को सबसे आम डिम्बग्रंथि के कैंसर, उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (एचजीएससी) का ऊतक-मूल माना जाता है। एचजीएससी गर्भाशय से बाहर फैलोपियन ट्यूब के क्षेत्र में शुरू होता है, जो अंडाशय से सटे होता है, लेकिन समीपस्थ फैलोपियन ट्यूब नहीं। हालांकि, एचजीएससी के पारंपरिक माउस मॉडल पूरे ओविडक्ट को लक्षित करते हैं, और इस प्रकार मानव स्थिति को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। हम डिंबवाहिनी के साथ प्रतिबंधित क्षेत्रों में म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए ओविडक्ट लुमेन में और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में डीएनए, आरएनए, या राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) समाधान माइक्रोइंजेक्शन की एक विधि प्रस्तुत करते हैं। कैंसर मॉडलिंग के लिए इस पद्धति के कई फायदे हैं, जैसे 1) क्षेत्र / ऊतक / अंग और इलेक्ट्रोपोरेशन के क्षेत्र को लक्षित करने में उच्च अनुकूलनशीलता, 2) लक्षित सेल प्रकारों में उच्च लचीलापन (सेलुलर प्लैंसी) जब कैस 9 अभिव्यक्ति के लिए विशिष्ट प्रमोटरों के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, 3) इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या में उच्च लचीलापन (अपेक्षाकृत कम आवृत्ति), 4) कोई विशिष्ट माउस लाइन की आवश्यकता नहीं है (इम्यूनोसक्षम रोग मॉडलिंग), 5) जीन उत्परिवर्तन संयोजन में उच्च लचीलापन, और 6) सीआरई रिपोर्टर लाइन के साथ संयोजन में उपयोग किए जाने पर इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को ट्रैक करने की संभावना। इस प्रकार, यह लागत प्रभावी विधि मानव कैंसर की शुरुआत को पुन: उत्पन्न करती है।

Introduction

फैलोपियन ट्यूब, जिसे चूहों में ओविडक्ट कहा जाता है, एक ट्यूबलर संरचना है जो गर्भाशय को अंडाशय से जोड़ती है। यह स्तनधारी प्रजनन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, आंतरिक निषेचन और प्रीइम्प्लांटेशनविकास के लिए वातावरण प्रदान करता है। इसके महत्व के बावजूद, इसके कार्य और होमियोस्टैसिस के बारे में बहुत कम जानकारी है, आंशिक रूप से इन विट्रो निषेचन तकनीकों के विकास के कारण इस अंगसे संबंधित किसी भी बांझपन के मुद्दे को दरकिनार करना। हालांकि, यह माना गया है कि उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (एचजीएससी) के प्रीकैंसरस घाव, डिम्बग्रंथि के कैंसर का एक आक्रामक हिस्टोटाइप जो लगभग 75% डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा और 85% संबंधित मौतों के लिए जिम्मेदार है, डिस्टल फैलोपियन ट्यूब एपिथेलियम 5,6,7,8 तक ही सीमित हैं।. यह इंगित करता है कि हमारे शरीर में सभी कोशिकाएं ऑन्कोजेनिक अपमान के लिए समान रूप से अतिसंवेदनशील नहीं होती हैं, बल्कि प्रत्येक ऊतक / अंग में केवल अद्वितीय / अतिसंवेदनशील कोशिकाएं कैंसर में सेल-ऑफ-ओरिजिन बन जाती हैं - जिसे सेलुलर प्लिएन्सी9 कहा जाता है। इन लाइनों के साथ, यह दिखाया गया है कि अंडाशय से सटे डिस्टल फैलोपियन ट्यूब की उपकला कोशिकाएं बाकी ट्यूब10,11 से अलग हैं। इस प्रकार, एचजीएससी के पारंपरिक माउस मॉडल, जो ओविडक्ट में सभी कोशिकाओं को लक्षित करते हैं, मानव स्थिति को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। हाल के एक अध्ययन में, हमने डिस्टल माउस ओविडक्ट12,13 में चार ट्यूमर शमन जीन को परिवर्तित करके एचजीएससी को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए विवो ओविडक्ट इलेक्ट्रोपोरेशन और सीआरई-आधारित वंश अनुरेखण में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन के संयोजन का उपयोग किया। यह पांडुलिपि माउस ओविडक्ट म्यूकोसल एपिथेलियम को लक्षित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन की इस प्रक्रिया का वर्णन करते हुए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है।

इस विधि के कई फायदे हैं। इसे अंग पैरेन्काइमा14 सहित अन्य ऊतकों / अंगों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि लेंटीवायरल और एडेनोवायरल सिस्टम जैसे अन्य विवो जीन डिलीवरी दृष्टिकोणों का उपयोग समान ऊतक / अंग-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लक्ष्यीकरण के क्षेत्र को इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण के लिए चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड के विभिन्न आकारों का उपयोग करके अधिक आसानी से समायोजित किया जाता है। राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी), इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर और इलेक्ट्रोड के आकार की एकाग्रता के आधार पर, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या को बदला जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट सेल प्रकारों को लक्षित किया जा सकता है जब कैस 9 अभिव्यक्ति के लिए प्रोमोटर्स के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, जर्मलाइन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जी-जीईएमएम) की पूर्ण आवश्यकता के बिना। इसके अलावा, वायरल डिलीवरी सिस्टम के विपरीत, इलेक्ट्रोपोरेशन एकल कोशिकाओं में कई प्लास्मिड डिलीवरी की अनुमति देता है और डीएनए आकार15 डालने में कम बाधा डालता है। विवो में जीन उत्परिवर्तन की स्क्रीनिंग भी इस उच्च लचीलेपन के कारण सापेक्ष आसानी से की जा सकती है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को ट्रैक या ट्रेस किया जा सकता है जब इस विधि का उपयोग क्रे रिपोर्टर लाइनों जैसे कि टीडीटोमेटो या कॉन्फेट्टी16,17 के साथ संयोजन में किया जाता है।

Protocol

जानवरों को फिल्टर टॉप के साथ स्थिर माइक्रोआइसोलेशन पिंजरों में रखा गया था, जो एक समर्पित कमरे में स्थित था जिसमें टाइप II जैव सुरक्षा कैबिनेट था। सभी पशु कार्य संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे और मैकगिल विश्वविद्यालय के चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान पशु देखभाल समिति (एयूपी # 7843) के संकाय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करना

  1. निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ एक माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके एक ग्लास केशिका ट्यूब को एक तेज बिंदु में खींचें: पी = 500, हीट = 576, पुल = 50, वीईएल = 80, डीईएल = 70।
  2. पतला अल्ट्राफाइन टिप फोर्सेस की एक जोड़ी का उपयोग करके, खींचे गए केशिका ट्यूब के नुकीले छोर को एक छिद्रित माइक्रोस्कोप के तहत स्निप करें ताकि एक उद्घाटन बनाया जा सके, जैसा कि चित्र 1 ए, बी में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि उद्घाटन बहुत बड़ा नहीं है, क्योंकि यह डिंबवाहिनी को नुकसान पहुंचाएगा और धीमी गति से इंजेक्शन को रोक देगा।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयारी । (ए, बी) एक नुकीले छोर (ए) के साथ खींची गई केशिका ट्यूब जिसे एक उद्घाटन (बी) बनाने के लिए डुबोया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के लिए एनेस्थेटिक तैयार करना

  1. सर्जरी के दिन फ़िल्टर किया हुआ, पतला एवर्टिन तैयार करें। एवर्टिन (2,2,2-ट्राइब्रोमोइथेनॉल) स्टॉक समाधान जोरदार सरगर्मी द्वारा टर्ट-एमाइल अल्कोहल में 1.6 ग्राम / एमएल की एकाग्रता पर तैयार किया जाता है और अंधेरे में संग्रहीत किया जाता है।
  2. एवर्टिन स्टॉक घोल को 1.25% वी /वी आइसोटोनिक सेलाइन के साथ 20 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता में फ्यूम हुड के अंदर पतला करें। पतला एवर्टिन को भंवर करें और 0.22 μm बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। अंधेरे में रहो।

3. सर्जरी क्षेत्र तैयार करना

  1. सर्जरी क्षेत्र एक समर्पित बाँझ वातावरण होना चाहिए, अधिमानतः एक साफ बेंच या जैव सुरक्षा कैबिनेट। आवश्यकतानुसार बाँझ सर्जरी उपकरण, माइक्रोस्कोप, माइक्रोमैनिपुलेटर और इलेक्ट्रोपोरेटर की व्यवस्था करें। इसका एक उदाहरण चित्र 2 में दिखाया गया है।
  2. हीटिंग पैड / डिस्क को गर्म करें और इसे एक साफ, पूरी तरह से सुसज्जित पिंजरे के नीचे रखें। इस पिंजरे का उपयोग सर्जरी के बाद चूहों को रखने के लिए किया जाएगा।
  3. बाँझ 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) को बाँझ पेट्री डिश में डालें। 1 सेमी x 1 सेमी के अनुमानित आयामों के साथ शोषक कागज को वर्गों में काटने के लिए साफ कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। अवशोषक कागज के इन टुकड़ों को भिगोने के लिए 1x PBS में छोड़ दें।

4. इंजेक्शन के लिए घोल और सुई तैयार करना

  1. सर्जरी के दिन इंजेक्शन का घोल तैयार करें। डीएनए/आरएनए/आरएनपी को फ़िल्टर किए गए ट्राइपैन ब्लू के साथ मिलाकर क्रमशः 200 एनजी/μL और 5% की न्यूनतम अंतिम सांद्रता में मिलाएं। इंजेक्शन से पहले कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: 100% ट्राइपैन ब्लू लेने के लिए 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और उपयोग से पहले 0.22 μm बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  2. खींची गई केशिका सुई, जिसे अब से माइक्रोइंजेक्शन सुई कहा जाता है, को एक चुंबकीय माउंट ( चित्रा 2 बी में दिखाया गया सेटअप) द्वारा स्थिर क्लैंप माउंट माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें।
  3. एक बाँझ पेट्री डिश पर इंजेक्शन समाधान के पिपेट 2 μL. माइक्रोस्कोप के नीचे अवलोकन करते समय, धीरे-धीरे माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़े हवा के दबाव वाले सिरिंज का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन सुई में इस घोल के 1-2 μL लें। माइक्रोइंजेक्शन सुई में बुलबुले लेने से बचें।

Figure 2
चित्र 2: सर्जरी क्षेत्र की तैयारी। (ए) एक साफ बेंच के अंदर सर्जरी क्षेत्र सेटअप। (बी) दाएं हाथ के व्यक्ति के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप और माइक्रोमैनिपुलेटर सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. महिला प्रजनन पथ को उजागर करना

  1. 6-8 सप्ताह की मादा माउस को 0.25-0.5 मिलीग्राम / जी की खुराक पर फ़िल्टर किए गए, पतला एवर्टिन (एनेस्थेटिक) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करके एनेस्थेटाइज करें। इसके बाद, 5 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर चमड़े के नीचे कारप्रोफेन (प्रीमेप्टिव एनाल्जेसिक) का प्रशासन करें।
    नोट: अन्य विकल्प जो एनेस्थेटिक के रूप में उपयोग किए जा सकते हैं वे आइसोफ्लुरेन या केटामाइन /
  2. एक साफ, गर्म पैड / डिस्क पर शोषक कागज रखें। फिर, इस गर्म शोषक पेपर पर एनेस्थेटाइज्ड माउस को पृष्ठीय पक्ष के साथ रखें। सर्जरी के दौरान सूखने से बचाने के लिए प्रत्येक आंख पर नेत्र स्नेहक लागू करें।
    नोट: पुष्टि करें कि हीटिंग पैड / डिस्क हाथ के पीछे परीक्षण करके स्पर्श के लिए थोड़ा गर्म है।
  3. एनेस्थेटाइज्ड माउस के पैर की अंगुली को बल की एक जोड़ी के साथ पिंच करके गहरी एनेस्थेटिक गिरफ्तारी के लिए परीक्षण करें। संभावित चीरा स्थल ( चित्रा 3 ए में दिखाए गए स्थान) के आसपास पृष्ठीय फर हटा दें और एंटीसेप्टिक के साथ नंगे त्वचा को पोंछ दें।
  4. नंगी त्वचा को चुटकी लेने के लिए सीधे कुंद बल की एक जोड़ी का उपयोग करें और बाँझ तेज कुंद कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके शरीर की मध्य रेखा के साथ 1 सेमी लंबा चीरा बनाएं। एंटीसेप्टिक के साथ चीरे के आसपास के क्षेत्र को साफ करें।
  5. बाँझ एडसन फोर्सप्स की एक जोड़ी का उपयोग करके कट साइट के एक तरफ चुटकी लें और पकड़ें। फिर, बाँझ घुमावदार सेरेटेड बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, धीरे से शरीर की दीवार से त्वचा को अलग करें, मध्य रेखा चीरा से शुरू करें और पार्श्व की ओर बढ़ें।
  6. गुर्दे के नीचे वसा पैड का पता लगाएं। बाँझ सीधे कुंद बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, वसा पैड के ऊपर सीधे शरीर की दीवार को चुटकी लें। रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए बाँझ तेज-नुकीले विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके शरीर की दीवार में एक छोटा चीरा बनाएं।
  7. अभी भी शरीर की दीवार को सीधे कुंद बल से चुटकी लेते हुए, बाँझ कुंद घुमावदार बल की एक जोड़ी चीरे में डालें और शरीर की दीवार में बने चीरे को चौड़ा करें।
  8. दिखाई देने वाले वसा पैड को कुंद घुमावदार बल के साथ पकड़ें और अंडाशय, डिंबवाहिनी और गर्भाशय को उजागर करने के लिए इसे छेद से बाहर खींचें।
  9. प्रजनन पथ को उजागर रखने के लिए, वसा पैड को बाँझ बुलडॉग क्लैंप के साथ दबाएं, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।

6. विवो ओविडक्ट इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन में

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर उजागर प्रजनन पथ के साथ गर्म शोषक कागज और एनेस्थेटाइज्ड माउस को ध्यान से रखें, ताकि पथ को देखा जा सके। माइक्रोस्कोप के नीचे देखे गए दृश्य का एक उदाहरण चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।
  2. माइक्रोमैनिपुलेटर को समायोजित करें ताकि माइक्रोस्कोप के नीचे समाधान के साथ इंजेक्शन सुई भी देखी जा सके।
  3. बाँझ पतले अल्ट्राफाइन टिप फोर्सप्स की एक जोड़ी का उपयोग करके, डिंबवाहिनी के क्षेत्र को पकड़ें जिसे स्थिर रूप से इंजेक्ट किया जाना है। इंजेक्ट किया जाने वाला क्षेत्र माइक्रोइंजेक्शन सुई की दिशा के अनुरूप होना चाहिए।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो पथ को धीरे-धीरे एक इष्टतम स्थिति में मोड़ने / स्थानांतरित करने के लिए वसा पैड और प्रजनन पथ को लंगर डालने वाले बुलडॉग क्लैंप का उपयोग करें।
  4. माइक्रोइंजेक्शन सुई के साथ डिंबवाहिनी को पंचर करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर को समायोजित करें, साथ ही साथ टेपर्ड अल्ट्राफाइन टिप फोर्सप्स का उपयोग करके डिंबवाहिनी को सुई पर खिलाएं। माइक्रोइंजेक्शन सुई को धीरे से हिलाएं ताकि यह पुष्टि हो सके कि इसे ओविडक्ट में डाला गया है।
    नोट: इंजेक्शन समाधान के कई पंचर और रिसाव को रोकने के लिए कुंडलित ओविडक्ट के एक मोड़ बिंदु के बजाय माइक्रोइंजेक्शन सुई को सीधे खंड में डालें।
  5. माइक्रोस्कोप के तहत नीले घोल की गति और ओविडक्ट लुमेन के विस्तार को देखते हुए, धीरे-धीरे डिंबवाहिनी में 1 μL तक घोल इंजेक्ट करें। ध्यान रखें कि लुमेन में किसी भी बुलबुले को पेश न करें। 100% ट्राइपैन ब्लू के साथ इंजेक्ट किए गए ओविडक्ट्स की प्रतिनिधि छवियां चित्रा 3 सी, डी में दिखाई गई हैं।
  6. डिंबवाहिनी से सुई निकालें। बाँझ 1x पीबीएस (चरण 3.3 से) में भिगोए गए अवशोषक कागज के एक टुकड़े के साथ लक्षित किए जाने वाले क्षेत्र को कवर करें।
  7. पहले से भिगोए हुए कागज और क्षेत्र /क्षेत्र को इलेक्ट्रोड ट्वीज़र्स (1 मिमी, 3 मिमी, या 5 मिमी, लक्षित क्षेत्र के आकार के आधार पर) की एक जोड़ी के साथ लक्षित करें और पल्स जनरेटर / इलेक्ट्रोपोरेटर पर इन सेटिंग्स का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेटिंग करने से पहले शरीर से दूर खींचें: 30 वी, तीन दालें, 1 सेकंड अंतराल, 50 एमएस पल्स लंबाई, एकध्रुवीय।
    नोट: इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी इस तरह से निर्धारित की जानी चाहिए कि इलेक्ट्रोड डिंबवाहिनी को सूचित किए बिना लक्षित क्षेत्र पर क्लैंप कर सकें। अनुशंसित दूरी लगभग 1 मिमी है।
  8. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, शोषक पेपर को हटा दें और माउस (नीचे गर्म शोषक पेपर के साथ) को वापस हीट पैड पर रखें। बुलडॉग क्लैंप को खोलें और ध्यान से उजागर प्रजनन पथ को शरीर की दीवार के नीचे वापस धकेल दें। दूसरी तरफ प्रजनन पथ को उजागर करने के लिए खंड 5 को दोहराएं।
    नोट: जब तक लुमेन समाधान से भरा होता है, तब तक माउस एस्ट्रस चरण की परवाह किए बिना इलेक्ट्रोपोरेशन सफल होता है।
  9. इसे सूखने से रोकने के लिए बाँझ 1x पीबीएस में भिगोए गए शोषक पेपर के साथ उजागर पथ को कवर करें, फिर चरण 4.2 और 4.3 को दोहराकर दूसरे इंजेक्शन के लिए माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करें।
    नोट: आवश्यकतानुसार माइक्रोइंजेक्शन सुई बदलें। आवश्यकता होने पर बाँझ 1x पीबीएस लागू करके उजागर ऊतक को सूखने से रोकें।
  10. विरोधी पक्ष पर ओविडक्ट को इंजेक्ट और इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं।
    नोट: सर्जरी के दौरान और बाद में आवश्यकतानुसार आंख स्नेहक को फिर से लागू करें।
  11. दोनों अंडाणुओं को इलेक्ट्रोपोरेट करने के बाद शरीर की दीवार के नीचे वापस रखा जाता है, पृष्ठीय चीरा स्थल को सीवन या स्टेपल किया जाता है। व्याख्यान के लिए, रेशम की चोटी वाली सीवन (3/8 सर्कल; गेज: 5-0; सुई का आकार: 18 मिमी; धागे की लंबाई: 75 सेमी) की सुई को पकड़ने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें। बाँझ घुमावदार घुमावदार छिद्रित बल की एक जोड़ी का उपयोग करके कट साइट के एक तरफ चुटकी लें और पकड़ें, फिर घाव को बंद करने के लिए सीवन में हेरफेर करने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें।
  12. माउस को एक साफ पिंजरे में ले जाएं जो गर्म पैड / डिस्क (चरण 3.2 से) के शीर्ष पर रखा गया है और माउस सक्रिय होने तक निगरानी करें।
  13. अगले 3 दिनों के लिए हर 24 घंटे में 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन को चमड़े के नीचे प्रशासित करें और अगले 10 दिनों में निगरानी करें।

Figure 3
चित्रा 3: महिला प्रजनन पथ जोखिम और माइक्रोइंजेक्शन । (ए) रोजा-एलएसएलटीडी टमाटर माउस के पृष्ठीय पक्ष पर मध्य रेखा चीरा (पीली रेखा के रूप में दिखाया गया) का स्थान। (बी) महिला प्रजनन पथ जोखिम। पथ को लंगर डालने और इसे उजागर रखने के लिए एक बाँझ बुलडॉग क्लैंप का उपयोग करके वसा पैड को दबा दिया गया था। (C, D) विवो ओविडक्ट इंजेक्शन में प्रतिनिधि छवियां। एक माइक्रोइंजेक्शन सुई को डिस्टल एम्पुला (लेबल एएमपी) में डाला गया था, और फ़िल्टर किए गए 100% ट्राइपैन ब्लू को ओविडक्ट लुमेन में इंजेक्ट किया गया था, जबकि ट्रैक्ट को उजागर किया गया था (सी)। एक विच्छेदित डिंबवाहिनी की प्रतिनिधि छवि, यह दर्शाती है कि इंजेक्शन ट्राइपैन ब्लू समाधान डिस्टल और समीपस्थ ओविडक्ट लुमेन (डी) में वितरित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

चित्र 1 और चित्रा 2 क्रमशः माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयारी और सर्जरी क्षेत्र सेटअप को दर्शाते हैं, जो विवो माइक्रोइंजेक्शन और माउस ओविडक्ट के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए है। सर्जरी के दौरान, महिला प्रजनन पथ को पृष्ठीय त्वचा (चित्रा 3 ए) और एनेस्थेटाइज्ड रोजा-एलएसएलटीडी टमाटर (जीटी (आरओएसए) 26 एसओआरटीएम 14 (सीएजी-टीडी टमाटर) एचजेडई / जे) 17 माउस की शरीर की दीवार में किए गए चीरों के माध्यम से उजागर किया गया था। एक बुलडॉग क्लैंप को ट्रैक्ट के ऊपर वसा पैड पर लगाया गया था ताकि इसे उजागर और लंगर डाला जा सके (चित्रा 3 बी)। μL सांद्रता पर PCS2 CreNLS प्लास्मिड18 युक्त इंजेक्शन समाधान को कुंडलित डिंबवाहिनी के एम्पुला (लेबल एएमपी) में इंजेक्ट किया गया था और पूरे ओविडक्ट लुमेन (चित्रा 3 सी, डी) में फैलाने की अनुमति दी गई थी। यद्यपि इस पांडुलिपि में प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए PCS2 CreNLS प्लास्मिड का उपयोग किया गया था, वर्णित विधि का उपयोग माउस ओविडक्ट में CRISPR / Cas-मध्यस्थता जीन संपादन के लिए इंजेक्शन समाधान में आसानी से विनिमेय डीएनए / आरएनए / RNP के साथ किया जा सकता है। फिर, 1 मिमी या 3 मिमी चिमटी प्रकार के इलेक्ट्रोड तैनात किए गए थे, जैसे कि इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित डिलीवरी के लिए इलेक्ट्रोड के बीच डिस्टल ओविडक्ट था।

सर्जरी के 4 दिन बाद ओविडक्ट्स को काटा गया और इलेक्ट्रोपोरेशन विशिष्टता की कल्पना करने के लिए मेसोसलपिंक्स को हटाकर फैलाया गया। 1 मिमी या 3 मिमी चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, लक्षित क्षेत्र, जिसे टीडीटोमेटो के साथ लेबल किया गया था, को डिस्टल ओविडक्ट एपिथेलियम (चित्रा 4 ए, डी) तक सीमित किया गया था। इस लक्षित क्षेत्र के आकार को विभिन्न आकारों के इलेक्ट्रोड का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था। 3 मिमी चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हुए, हमने 1 मिमी चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करके केवल डिस्टल-मोस्ट टिप, आईएनएफ (चित्रा 4 ई, एफ) को लक्षित करने की तुलना में एएमपी (चित्रा 4 बी, सी) के एक बहुत बड़े क्षेत्र को लक्षित किया। इन कटे हुए अंडाणुओं को तय किया गया, सुक्रोज ढाल के साथ इलाज किया गया, और विस्तृत विश्लेषण के लिए क्रायोस्टैट का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया। वर्गों को क्रमशः नाभिक और साइटोस्केलेटन को दागने के लिए होस्क ्ट 33342 और फेलोइडिन के साथ प्रतिरूप किया गया था, फिर उन्हें पॉइंट-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। लक्षित क्षेत्र में, टीडीटोमेटो द्वारा चिह्नित इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को यादृच्छिक रूप से गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड (टीडीटमाटर-वे) कोशिकाओं (चित्रा 4 जी) के बीच वितरित किया गया था। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाएं म्यूकोसल एपिथेलियम तक ही सीमित थीं और अंतर्निहित स्ट्रोमल या मांसपेशी परत (चित्रा 4 जी, एच) में नहीं पाई गईं। अंत में, CRISPR-Cas-मध्यस्थता जीन संपादन की पुष्टि करने के लिए, TdTomato+ve कोशिकाओं को डीएनए अलगाव और MiSeq अनुक्रमण12 के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) द्वारा अलग किया जा सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: सर्जरी के 4 दिन बाद विवो इंजेक्शन और ओविडक्ट एपिथेलियल कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन में सफल सत्यापन। (ए-सी) 3 मिमी आकार के चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन। इलेक्ट्रोपोरेशन विशिष्टता (ए) के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए मेसोसलपिनक्स को हटाकर ओविडक्ट को अनकॉइल किया गया था। टीडीटोमेटो अभिव्यक्ति द्वारा पहचाने जाने वाले इलेक्ट्रोपोरेशन क्षेत्र को डिस्टल ओविडक्ट तक सीमित किया गया था, जिसे एएमपी (बी, सी) लेबल किया गया था। (D-F) 1 मिमी आकार के चिमटी प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन। इलेक्ट्रोपोरेशन विशिष्टता (डी) के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए मेसोसलपिनक्स को हटाकर ओविडक्ट को अनकॉइल किया गया था। इलेक्ट्रोपोरेशन क्षेत्र को इंफंडिबुलम (लेबल आईएनएफ) तक सीमित किया गया था, जो ओविडक्ट (ई, एफ) का सबसे दूर का सिरा है। (जी, एच) पीसीएस 2 क्रेएनएलएस प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 4 दिन बाद डिस्टल ओविडक्ट का अनुप्रस्थ खंड। टीडीटोमैटो (जी) के साथ लेबल की गई इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाएं उपकला मोनोलेयर (एच) तक ही सीमित थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस विस्तृत प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम ओविडक्ट लुमेन में डीएनए / आरएनए / आरएनपी समाधान का माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन ताकत और क्षेत्र का नियंत्रण है। माइक्रोइंजेक्शन के दौरान डीएनए/आरएनए/आरएनपी घोल रिसाव के कारण अवांछित क्षेत्रों/कोशिकाओं का अभिकर्मक हो सकता है। सुसंगत और कुशल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, समाधान (चित्रा 3 सी, डी) के साथ ओविडक्ट लुमेन को भरना बेहतर है। ऐसा इसलिए है क्योंकि इलेक्ट्रोपोरेशन का क्षेत्र मुख्य रूप से इलेक्ट्रोड आकार और प्लेसमेंट द्वारा नियंत्रित होता है। कमजोर इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या को कम करता है, और कठोर इलेक्ट्रोपोरेशन अवांछित कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन का कारण बन सकता है या ऊतक संरचना को बाधित कर सकता है। डीएनए / आरएनए / आरएनए समाधान एकाग्रता या इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों को समायोजित करके इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या को भिन्न किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान उच्च वोल्टेज / गर्मी उत्पादन ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, इसलिए इन मापदंडों को जीवित / एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। अंत में, इस प्रक्रिया की मांग प्रकृति के कारण, जीवित / एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर इस सर्जरी को करने से पहले मृत चूहों पर ट्रैक्ट एक्सपोजर और माइक्रोइंजेक्शन का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।

यह माना जाता है कि कैंसर की शुरुआत में कई जीन शामिल होते हैं, इस प्रकार, इस घटना को पुन: उत्पन्न करने के लिए कई जीनों के बहु-एलील संशोधन की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यह भी ज्ञात है कि सभी कोशिकाएं ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन9 के लिए समान रूप से अतिसंवेदनशील नहीं हैं। इसलिए, कैंसर मॉडलिंग को ऑन्कोजेनिक अपमान के कड़े नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए विशिष्ट क्रे माउस लाइनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, उनकी उपलब्धता और विशिष्टता विभिन्न चुनौतियों का कारण बनती है, जिसमें गैर-लक्षित ऊतकों और घातकतामें प्रभाव शामिल हैं। इसके अलावा, पारंपरिक जी-जीईएमएम रखरखाव के लिए उच्च लागत उठाते हैं और माउस लाइन उत्पादन के लिए समय की आवश्यकता होती है। CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन तकनीक के विकास और विशिष्ट दैहिक कोशिकाओं में जीन वितरण में सुधार ने हमें इन मुद्दों को दूर करने की अनुमति दी है। इस प्रोटोकॉल में, हम दैहिक जीनोम हेरफेर के लिए एक डीएनए / आरएनए / आरएनपी वितरण विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग कैंसर मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है, विशिष्ट माउस लाइनों12 की पूर्ण आवश्यकता के बिना। डीएनए /आरएनए / आरएनपी समाधानों को लुमेन में इंजेक्ट करके और इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण के लिए चिमटी-प्रकार के इलेक्ट्रोड के विभिन्न आकारों का उपयोग करके, माउस ओविडक्ट म्यूकोसल एपिथेलियम के प्रतिबंधित क्षेत्रों को लक्षित किया जाता है (चित्रा 4 ए-एफ)। यह विशेष रूप से एचजीएससी की दीक्षा को मॉडलिंग में उपयोगी है जो फैलोपियन ट्यूब के डिस्टल छोर से उत्पन्न होता है।

प्रस्तुत माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन विधि में एक लुमेन के साथ ऊतकों / अंगों को लक्षित करने के लिए अत्यधिक बहुमुखी है। इस विधि14 का उपयोग करके अंग पैरेन्काइमा भी लक्षित है। लेंटिवायरल और एडेनोवायरल सिस्टम जैसे वायरल डिलीवरी दृष्टिकोण का उपयोग इसी तरह के उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, वायरल डिलीवरी दृष्टिकोण पर इलेक्ट्रोपोरेशन के फायदे हैं: 1) एकल कोशिकाओं में कई प्लास्मिड वितरण, 2) सम्मिलित आकार15 पर कोई प्रतिबंध नहीं, और 3) क्षेत्र और वितरण के समय का आसान नियंत्रण। इसके अलावा, वंश विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके लक्ष्यीकरण विशिष्टता में सुधार किया जा सकता है। वायरल पैकेजिंग पर सीमा के कारण वायरल सिस्टम में यह कभी-कभी मुश्किल होता है।

जैसा कि इलेक्ट्रोपोरेशन की प्रकृति है, इलेक्ट्रोपोरेटेड उपकला कोशिकाओं को यादृच्छिक रूप से स्वस्थ, असंपादित कोशिकाओं (चित्रा 4 जी) के साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, आनुवंशिक रूप से संशोधित और असंशोधित कोशिकाओं में यह मोज़ेकिज्म कैंसर की शुरुआत का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि यह एक इम्यूनोसक्षम माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर प्रारंभिक कैंसर दीक्षा की छिटपुट प्रकृति को पुन: उत्पन्न करता है। इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की आवृत्ति को डीएनए / आरएनए / आरएनपी समाधान सांद्रता और / या इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों को बदलकर समायोजित किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में CRISPR-Cas-मध्यस्थ जीन संपादन का उपयोग करके, कई जीनों को स्क्रीन करना और लक्षित जीनों में उत्परिवर्तन / एलील संयोजनों के विषम पैटर्न उत्पन्न करना आसान है; यह कैंसर मॉडलिंग में विशेष रूप से उपयोगी है जो एचजीएससी20,21 जैसे जीनोमिक परिवर्तनों की काफी संख्या के साथ मौजूद है। इसके अलावा, कैंसर की प्रगति के दौरान लक्षित जीन ों को अनुक्रमित करके, इम्यूनोसक्षमचूहों में ट्यूमर और मेटास्टेस के विवो क्लोनल विकास का पालन करना संभव है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रतिनिधि परिणाम और प्रोटोकॉल अनुकूलन उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड प्रदान करने के लिए केटी टेंग और डॉ मैथ्यू जे फोर्ड को धन्यवाद देते हैं। केएच को फोंड्स डी रेचरचे डू क्यूबेक - सैंटे (एफआरक्यूएस) डॉक्टरेट अनुदान, डोनर फाउंडेशन, डेल्टा कप्पा गामा वर्ल्ड फैलोशिप, सेंटर फॉर रिसर्च इन रिप्रोडक्शन एंड डेवलपमेंट (सीआरआरडी), ह्यूग ई बर्क, रोलैंड और मार्सेल गोसेलिन और अलेक्जेंडर मैकफी स्नातक छात्रों द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm sterile filter unit  LifeGene SF0.22PES
1 mL syringe Terumo Medical Corportation SS-01T
1 mm tweezer-type electrodes BEX CO., LTD LF650P1
3 mm tweezer-type electrodes BEX CO., LTD LF650P3
30G x 1/2 Needle BD 305106 Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic.
Adson forceps Fisher Scientific 10-000-451
Air-pressured syringe BD B302995 Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B
Analgesic - - Carprofen, dose: 5mg/kg.
Antiseptic Cardinal Health OMEL0000017 Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) - Anesthetic Sigma Aldrich T48402-25G
Clamp mount micromanipulator AD Instruments MM-33
Curved serrated forceps Fisher Scientific NC0696845
Dissecting microscope Zeiss SteREO Discovery.V8 Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B.
Eye lubricant Alcon - Systane ointment (Lubricant eye ointment)
Glass capillary needles Sutter Instrument Co. B100–50-10 Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm
Hartman hemostats Fisher Scientific 50-822-711
Heating pad/disc  - - SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand.
Magnetic Mount for micromanipulator AD Instruments MB-B Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection.
Micro bulldog clamp Fisher Scientific 50-822-230 3 cm
Micropipette puller Sutter Instrument Co. P-97 P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70
Petri dish Fisher Scientific 263991 Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Bio Basic Inc. PD8117 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. 
Pulse generator/Electroporator BEX CO., LTD CUY21 EDIT II Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar
Rosa-LSLtdTomato mice The Jackson Laboratory 7914 Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J
Sharp-blunt dissection scissors Fisher Scientific 28251
Sharp-pointed dissecting scissors Fisher Scientific SDI130
Shaver - - Hair removal cream can also be used.
Silk braided sutures Ethicon 682G 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used.
Tapered ultrafine tip forceps  Fisher Scientific 12-000-122
Thin absorbent paper Kimberly-Clark Professional 34120 Kimwipes
Trypan blue STEMCELL Technologies 7050 Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection.

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References

  1. Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events. Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).
  2. Li, S., Winuthayanon, W. Oviduct: roles in fertilization and early embryo development. The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).
  3. Briceag, I., et al. Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility. Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).
  4. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  5. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature Communications. 8 (1), 1093 (2017).
  6. Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers. Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).
  7. Soong, T. R., et al. Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas. The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).
  8. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
  9. Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis. Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).
  10. Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
  11. Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
  12. Teng, K., et al. Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).
  13. Ford, M. J., Yamanaka, Y. Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation. Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).
  14. Maresch, R., et al. Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice. Nature Communications. 7, 10770 (2016).
  15. Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens. Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  17. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  18. Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway. Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).
  19. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  20. Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
  21. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).

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कैंसर रिसर्च अंक 195 सीआरआईएसपीआर / सीएएस जीनोम संपादन फैलोपियन ट्यूब ओविडक्ट डिम्बग्रंथि के कैंसर विवो कैंसर मॉडलिंग में ।
विवो माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन <em>में</em> उपयोग कर दैहिक जीनोम-इंजीनियर माउस मॉडल
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Harwalkar, K., Yamanaka, N.,… More

Harwalkar, K., Yamanaka, N., Yamanaka, Y. Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation. J. Vis. Exp. (195), e65131, doi:10.3791/65131 (2023).

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