Summary
Detta protokoll beskriver mikroinjektion och in vivo-elektroporering för regionalt begränsad CRISPR-medierad genomredigering i musovidukten.
Abstract
Germline genetiskt modifierade musmodeller (G-GEMM) har gett värdefull insikt i in vivo-genfunktion vid utveckling, homeostas och sjukdom. Tiden och kostnaden för att skapa och underhålla kolonier är dock hög. De senaste framstegen inom CRISPR-medierad genomredigering har möjliggjort generering av somatiska GEMM (S-GEMM) genom att direkt rikta in sig på cellen / vävnaden / organet av intresse.
Äggledaren, eller äggledaren hos människor, anses vara ursprungsvävnaden för den vanligaste äggstockscancern, högkvalitativa serösa äggstockscancer (HGSC). HGSC initierar i äggledarens område distalt mot livmodern, som ligger intill äggstocken, men inte det proximala äggledaren. Traditionella musmodeller av HGSC riktar sig emellertid mot hela äggledaren och rekapitulerar därför inte det mänskliga tillståndet. Vi presenterar en metod för DNA-, RNA- eller ribonukleoproteinlösning (RNP) lösning mikroinjektion i oviduktlumen och in vivo elektroporering för att rikta mukosala epitelceller i begränsade regioner längs äggledaren. Det finns flera fördelar med denna metod för cancermodellering, såsom 1) hög anpassningsförmåga vid inriktning på området / vävnaden / organet och regionen för elektroporering, 2) hög flexibilitet i riktade celltyper (cellulär smidighet) när den används i kombination med specifika promotorer för Cas9-uttryck, 3) hög flexibilitet i antalet elektroporerade celler (relativt låg frekvens), 4) ingen specifik muslinje krävs (immunokompetent sjukdomsmodellering), 5) hög flexibilitet i genmutationskombination, och 6) möjlighet att spåra elektroporerade celler när de används i kombination med en Cre-rapportlinje. Således rekapitulerar denna kostnadseffektiva metod mänsklig cancerinitiering.
Introduction
Äggledaren, kallad ovidukten hos möss, är en rörformig struktur som förbinder livmodern med äggstocken. Det spelar en viktig roll i däggdjurens reproduktion och ger miljön för intern befruktning och preimplantatorisk utveckling 1,2. Trots dess betydelse är lite känt om dess funktion och homeostas, delvis på grund av utvecklingen av in vitro-fertiliseringstekniker som kringgår eventuella infertilitetsproblem relaterade till detta organ3. Det har emellertid erkänts att precancerösa lesioner av högkvalitativt seröst äggstockscancer (HGSC), en aggressiv histotyp av äggstockscancer som står för cirka 75% av äggstockscancer och 85% av relaterade dödsfall4, är begränsade till det distala äggledarepitelet 5,6,7,8 . Detta indikerar att inte alla celler i vår kropp är lika mottagliga för onkogena förolämpningar, utan snarare bara unika / mottagliga celler i varje vävnad / organ blir ursprungscellen i cancer - kallad cellulär pliancy9. I linje med detta har det visats att epitelcellerna i det distala äggledaren, som ligger intill äggstocken, skiljer sig från resten av röret10,11. Således rekapitulerar traditionella musmodeller av HGSC, som riktar sig mot alla celler i äggledaren, inte det mänskliga tillståndet. I en nyligen genomförd studie använde vi en kombination av CRISPR-medierad genomredigering, in vivo oviduktelektroporering och Cre-baserad härstamningsspårning för att framgångsrikt inducera HGSC genom att mutera fyra tumörsuppressorgener i den distala musovidukten12,13. Detta manuskript presenterar ett steg-för-steg-protokoll som beskriver denna procedur för mikroinjektion och in vivo-elektroporering för att rikta in sig på musens oviduktslemhinneepitel.
Denna metod har flera fördelar. Det kan anpassas för att rikta in sig på andra vävnader / organ, inklusive organparenkym14. Även om andra in vivo-genleveransmetoder som lentivirala och adenovirala system kan användas för att uppnå liknande vävnads-/organspecifik inriktning, justeras målområdet lättare med hjälp av olika storlekar av pincettelektroder för elektroporationsbaserad leverans. Beroende på koncentrationen av DNA / RNA / ribonukleoproteiner (RNP), elektroporeringsparametrar och elektrodernas storlek kan antalet elektroporerade celler ändras. Vidare kan specifika celltyper riktas när de används i kombination med promotorer för Cas9-uttryck, utan det absoluta behovet av Germline genetiskt modifierade musmodeller (G-GEMM). Dessutom, till skillnad från virala leveranssystem, möjliggör elektroporering multipel plasmidleverans till enskilda celler och mindre begränsning i insats-DNA-storlek15. In vivo-screening av genmutationer kan också utföras relativt enkelt på grund av denna höga flexibilitet. Vidare kan elektroporerade celler spåras eller spåras när denna metod används i kombination med Cre-reporterlinjer som Tdtomato eller Confetti16,17.
Protocol
Djuren hölls i statiska mikroisoleringsburar med filtertoppar, belägna i ett särskilt rum som innehöll ett biosäkerhetsskåp av typ II. Allt djurarbete utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och godkändes av McGill Universitys fakultet för medicin och hälsovetenskap djurvårdskommitté (AUP # 7843).
1. Förberedelse av mikroinjektionsnål
- Dra ett glaskapillärrör i en skarp punkt med en mikropipettdragare med följande program: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.
- Använd ett par avsmalnande ultrafina spetspincett, klipp den spetsiga änden av det dragna kapillärröret under ett dissekerande mikroskop för att skapa en öppning, som visas i figur 1A, B. Se till att öppningen inte är för stor, eftersom detta kommer att skada ovidukten och förhindra långsam injektion.
Figur 1: Förberedelse av mikroinjektionsnål. (A,B) Draget kapillärrör med spetsig ände (A) som klipptes för att skapa en öppning (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Förbereda bedövningsmedlet för intraperitoneal injektion
- Förbered filtrerat, utspätt avertin på operationsdagen. Stamlösning av avertin (2,2,2-tribrometanol) bereds vid en koncentration av 1,6 g/ml i tert-amylalkohol under kraftig omrörning och förvaras i mörker.
- Späd stamlösningen av avertin med 1,25 % v/v isoton saltlösning till en slutlig koncentration på 20 mg/ml inuti ett dragskåp. Virvla det utspädda avertinet och filtrera genom ett 0,22 μm sterilt filter. Håll dig i mörkret.
3. Förbereda operationsområdet
- Operationsområdet bör vara en dedikerad steril miljö, helst en ren bänk eller biosäkerhetsskåp. Ordna steril kirurgiutrustning, mikroskop, mikromanipulator och elektroporator efter behov. Ett exempel på detta visas i figur 2.
- Värm upp värmedynan/skivan och placera den under en ren, fullt utrustad bur. Denna bur kommer att användas för att hysa mössen efter operationen.
- Häll steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en steril petriskål. Använd en ren sax för att klippa absorberande papper i rutor, med ungefärliga mått på 1 cm x 1 cm. Släpp dessa bitar absorberande papper i 1x PBS för att blötlägga dem.
4. Beredning av lösning och injektionsnål
- Förbered injektionslösningen på operationsdagen. Blanda DNA / RNA / RNP med filtrerad trypanblå till en slutlig koncentration på minst 200 ng / μL vardera respektive 5%. Förvaras i rumstemperatur före injektion.
OBS: Använd en 1 ml spruta för att ta upp 100% trypan blå och filtrera genom ett 0,22 μm sterilt filter före användning. - Fäst den dragna kapillärnålen, hädanefter kallad mikroinjektionsnål, på klämfästets mikromanipulator stabiliserad med ett magnetfäste (inställningen visas i figur 2B).
- Pipettera 2 μl injektionslösning på en steril petriskål. Medan du observerar under mikroskopet, ta långsamt upp 1-2 μL av denna lösning i mikroinjektionsnålen med hjälp av den lufttryckta sprutan fäst vid mikromanipulatorn. Undvik bubblor/ta upp bubblor i mikroinjektionsnålen.
Figur 2: Förberedelse av operationsområdet . (A) Operationsområdet är inställt inuti en ren bänk. (B) Dissektionsmikroskop och mikromanipulatorinställning för en högerhänt individ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Exponera det kvinnliga reproduktionsorganet
- Bedöva en 6-8 veckor gammal honmus genom att administrera filtrerat, utspätt avertin (bedövningsmedel) intraperitonealt i en dos av 0,25-0,5 mg / g. Därefter administreras karprofen (förebyggande smärtstillande) subkutant i en dos av 5 mg/kg.
OBS: Andra alternativ som kan användas som bedövningsmedel är isofluran eller ketamin/xylazin. - Lägg absorberande papper på en ren, uppvärmd dyna/skiva. Placera sedan den bedövade musen på detta uppvärmda absorberande papper med ryggsidan uppåt. Applicera ögonsmörjmedel på varje öga för att förhindra torkning under operationen.
OBS: Kontrollera att värmedynan/skivan är något varm vid beröring genom att testa med baksidan av handen. - Test för djupt bedövningsstopp genom att nypa tån på den bedövade musen med ett par pincett. Ta bort dorsal päls runt det potentiella snittstället (plats visas i figur 3A) och torka av den nakna huden med antiseptiska medel.
- Använd ett par raka trubbiga pincett för att nypa den nakna huden och skapa ett 1 cm långt snitt längs kroppens mittlinje med en steril vass trubbig sax. Rengör området runt snittet med antiseptiska medel.
- Nyp och håll upp ena sidan av skärplatsen med ett par sterila Adson-pincett. Sedan, med hjälp av ett par sterila böjda tandade pincett, separera försiktigt huden från kroppsväggen, börja vid mittlinjens snitt och rör sig i sidled.
- Leta reda på fettkudden under njurarna. Använd ett par sterila raka trubbiga pincett, kläm kroppsväggen direkt ovanför fettkudden. Skapa ett litet snitt i kroppsväggen med ett par sterila skarpspetsiga dissekeringssaxar, var försiktig så att du undviker blodkärl.
- Medan du fortfarande klämmer kroppsväggen med raka trubbiga pincett, sätt in ett par sterila trubbiga böjda pincett i snittet och bredda snittet som skapas i kroppsväggen.
- Ta tag i den synliga fettkudden med de trubbiga böjda pincetterna och dra ut den ur hålet för att exponera äggstocken, äggledaren och livmodern.
- För att hålla reproduktionsorganen exponerade, kläm fast fettkudden med en steril bulldoggklämma, som visas i figur 3B.
6. In vivo oviduktinjektion och elektroporering
- Placera försiktigt det uppvärmda absorberande papperet och den bedövade musen med reproduktionsorganet exponerat på scenen i ett dissekeringsmikroskop, så att kanalen kan observeras. Ett exempel på vyn som observerats under mikroskopet visas i figur 3B.
- Justera mikromanipulatorn så att injektionsnålen med lösning också kan observeras under mikroskopet.
- Använd ett par sterila avsmalnande ultrafina spetspincett, håll området av äggledaren som ska injiceras stadigt. Det område som ska injiceras måste vara i linje med mikroinjektionsnålens riktning.
OBS: Använd bulldogklämman som förankrar fettdynan och reproduktionskanalen för att försiktigt vrida / flytta kanalen till en optimal position, om det behövs. - Justera mikromanipulatorn för att punktera äggledaren med mikroinjektionsnålen, samtidigt som du matar ovidukten på nålen med hjälp av de avsmalnande ultrafina spetspincetterna. Flytta försiktigt mikroinjektionsnålen för att bekräfta att den har förts in i äggledaren.
OBS: För in mikroinjektionsnålen i ett rakt segment istället för i en vändpunkt på den lindade äggledaren för att förhindra flera punkteringar och läckage av injektionslösningen. - Injicera långsamt upp till 1 μL lösning i äggledaren, medan du observerar rörelsen av den blå lösningen och expansionen av oviduktlumen under mikroskopet. Var försiktig så att du inte introducerar några bubblor i lumen. Representativa bilder av äggledare injicerade med 100% trypanblått visas i figur 3C,D.
- Ta bort nålen från äggledaren. Täck området som ska riktas med en bit absorberande papper förblött i steril 1x PBS (från steg 3.3).
- Ta tag i det förblötlagda papperet och området/området som ska riktas med en elektrodpincett (1 mm, 3 mm eller 5 mm, beroende på storleken på det område som ska riktas) och dra bort från kroppen innan du elektroporerar med dessa inställningar på pulsgeneratorn/elektroporatorn: 30 V, tre pulser, 1 s intervall, 50 ms pulslängd, unipolär.
OBS: Avståndet mellan elektroderna bör ställas in så att elektroderna kan klämma fast på det riktade området utan att deformera äggledaren. Det rekommenderade avståndet är cirka 1 mm. - Efter elektroporering, ta bort det absorberande papperet och placera musen (med det uppvärmda absorberande papperet under) tillbaka på en värmedyna. Lossa bulldogklämman och tryck försiktigt tillbaka det exponerade reproduktionsorganet under kroppsväggen. Upprepa avsnitt 5 för att exponera reproduktionsorganen på andra sidan.
OBS: Elektroporering är framgångsrik oavsett musens estrousstadium så länge lumen är fylld med lösningen. - Täck över det exponerade området med absorberande papper som är fördränkt i sterilt 1x PBS för att förhindra att det torkar ut och förbered sedan mikroinjektionsnålen för den andra injektionen genom att upprepa steg 4.2 och 4.3.
OBS: Sätt tillbaka mikroinjektionsnålen efter behov. Förhindra torkning av den exponerade vävnaden genom att applicera steril 1x PBS vid behov. - Upprepa stegen ovan för att injicera och elektroporera äggledaren på motsatt sida.
OBS: Applicera ögonsmörjmedlet efter behov under och efter operationen. - Efter att båda äggledarna har elektroporerats och placerats tillbaka under kroppsväggen, sutur eller häfta dorsala snittplatsen. För suturering, använd en hemostat för att ta tag i nålen på de silkeflätade suturerna (3/8 cirkel; mätare: 5-0; nålstorlek: 18 mm; trådlängd: 75 cm). Nyp och håll upp ena sidan av skärplatsen med ett par sterila böjda tandade pincett, använd sedan hemostaten för att manipulera suturen för att stänga såret.
- Flytta musen till en ren bur som placeras ovanpå en uppvärmd dyna/skiva (från steg 3.2) och övervaka tills musen är aktiv.
- Administrera 5 mg/kg karprofen subkutant var 24:e timme under de kommande 3 dagarna och övervaka under de kommande 10 dagarna.
Figur 3: Exponering för kvinnliga reproduktionsorgan och mikroinjektion . (A) Placering av snittet på mittlinjen (visas som en gul linje) på ryggsidan av en Rosa-LSLtdToto-mus. b) Exponering för reproduktionsorganen hos kvinnor. Fettkudden klämdes fast med en steril bulldogklämma för att förankra kanalen och hålla den exponerad. (C,D) Representativa bilder av in vivo oviduktinjektion. En mikroinjektionsnål sattes in i distala ampulla (märkt AMP) och filtrerad 100% trypanblå injicerades i oviduktlumen medan kanalen exponerades (C). Representativ bild av en dissekerad ovidukt, som visar att injicerad trypanblå lösning distribueras genom den distala och proximala oviduktlumen (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Figur 1 och figur 2 visar mikroinjektionsnålberedningen respektive operationsområdet för mikroinjektion in vivo och elektroporering av musovidukten. Under operationen exponerades det kvinnliga reproduktionsorganet genom snitt i rygghuden (figur 3A) och kroppsväggen hos en sövd Rosa-LSLtdTomato (Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomat) Hze / J) 17 mus. En bulldoggklämma klämdes fast på fettkudden ovanför kanalen för att hålla den exponerad och förankrad (figur 3B). Injektionslösning innehållande PCS2 CreNLS-plasmider18 vid 400 ng/μL koncentration injicerades i ampullen (märkt AMP) i den lindade ovidukten och tilläts dispergeras genom oviduktlumen (figur 3C,D). Även om PCS2 CreNLS-plasmider användes för att generera representativa resultat i detta manuskript, kan den beskrivna metoden användas med lätt utbytbart DNA / RNA / RNP i injektionslösningen för CRISPR / Cas-medierad genredigering i musovidukten. Därefter placerades elektroder av pincetttyp på 1 mm eller 3 mm, så att den distala ovidukten var mellan elektroderna för elektroporationsbaserad leverans.
Ovidukter skördades 4 dagar efter operationen och sträcktes ut genom att avlägsna mesosalpinx för att visualisera elektroporeringsspecificitet. Med hjälp av antingen 1 mm eller 3 mm pincettelektroder begränsades målområdet, märkt med TdTomato, till det distala oviduktepitelet (figur 4A, D). Storleken på detta målområde kontrollerades ytterligare med hjälp av elektroder av olika storlekar. Med hjälp av elektroder av 3 mm pincetttyp riktade vi in oss på ett mycket större område av AMP (figur 4B, C), jämfört med att bara rikta in oss på den distala spetsen, INF (figur 4E, F), med hjälp av elektroder av 1 mm pincetttyp. Dessa skördade äggledare fixerades, behandlades med sackarosgradient och snittades med en kryostat för detaljerade analyser. Sektioner motfärgades med Hoescht 33342 och Phalloidin för att färga kärnorna respektive cytoskelettet, sedan avbildades de med hjälp av ett punktskanningskonfokalmikroskop. I målregionen fördelades elektroporerade celler, markerade med TdTomato, slumpmässigt mellan icke-elektroporerade (TdTomato-ve) celler (figur 4G). Dessutom var elektroporerade celler begränsade till slemhinnans epitel och hittades inte i det underliggande stroma- eller muskelskiktet (figur 4G, H). Slutligen, för att bekräfta CRISPR-Cas-medierad genredigering, kan TdTomat+ve-celler isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för DNA-isolering och MiSeq-sekvensering12.
Figur 4: Validering av lyckad in vivo-injektion och elektroporering av oviduktepitelceller, 4 dagar efter operationen. (A–C) Elektroporering med elektroder av 3 mm pincetttyp. Ovidukten lindades upp genom att avlägsna mesosalpinx för bättre visualisering av elektroporationsspecificitet (A). Elektroporeringsområdet, identifierat med TdTomat-uttryck, begränsades till den distala äggledaren, märkt AMP (B, C). (D-F) Elektroporering med elektroder av 1 mm pincetttyp. Ovidukten lindades upp genom att avlägsna mesosalpinx för bättre visualisering av elektroporationsspecificitet (D). Elektroporeringsområdet var begränsat till infundibulum (märkt INF), den distala spetsen av äggledaren (E, F). (G,H) Tvärsnitt av den distala ovidukten 4 dagar efter elektroporering med PCS2 CreNLS-plasmider. Elektroporerade celler märkta med TdTomato (G) begränsades till epitelmonolagret (H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Avgörande steg i detta detaljerade protokoll är mikroinjektion av DNA / RNA / RNP-lösning i oviduktlumen och kontroll av elektroporeringsstyrkan och området. DNA/RNA/RNP-lösningsläckage under mikroinjektion kan orsaka transfektion av oönskade områden/celler. För konsekvent och effektiv elektroporering är det att föredra att fylla oviduktlumen med lösningen (figur 3C, D). Detta beror på att elektroporeringsområdet huvudsakligen styrs av elektrodstorlek och placering. Svag elektroporering minskar antalet elektroporerade celler, och hård elektroporering kan orsaka elektroporering av oönskade celler eller störa vävnadsstrukturen. Antalet elektroporerade celler kan varieras genom att justera DNA / RNA / RNP-lösningskoncentrationen eller elektroporeringsparametrarna. Men eftersom höga spänningar/värmeproduktion under elektroporering kan skada vävnaden, bör dessa parametrar testas före användning på levande/bedövade möss. Slutligen, på grund av den krävande karaktären av denna procedur, rekommenderas det att öva exponering i tarmkanalen och mikroinjektion på döda möss innan du utför denna operation på levande / bedövade möss.
Det är erkänt att flera gener är involverade i cancerinitiering, så rekapitulering av denna händelse kräver multiallelisk modifiering av flera gener. Dessutom är det också känt att inte alla celler är lika mottagliga för onkogena mutationer9. Cancermodellering kräver därför specifika Cre-muslinjer för att uppnå tät kontroll av onkogena förolämpningar. Deras tillgänglighet och specificitet orsakar dock olika utmaningar, bland annat effekter i vävnader som inte är måltavlor och dödlighet19. Dessutom medför traditionella G-GEM höga kostnader för underhåll och kräver tid för generering av muslinjer. Utvecklingen av CRISPR / Cas9 genomredigeringsteknik och förbättring av genleverans till specifika somatiska celler har gjort det möjligt för oss att övervinna dessa problem. I detta protokoll presenterar vi en DNA/RNA/RNP-leveransmetod för somatisk genommanipulation som kan användas för cancermodellering, utan det absoluta behovet av specifika muslinjer12. Genom att injicera DNA / RNA / RNP-lösningar i lumen och använda olika storlekar av pincetttypelektroder för elektroporeringsbaserad leverans, riktas begränsade områden av musens oviduktslemhinneepitel (figur 4A-F). Detta är särskilt användbart vid modellering av initiering av HGSC som härrör från den distala änden av äggledaren.
Den presenterade mikroinjektions- och in vivo-elektroporeringsmetoden är mycket mångsidig för att rikta vävnader / organ med en lumen. Orgelparenkym är också måltavla med denna metod14. Virala leveransmetoder, som lentivirala och adenovirala system, kan också användas för liknande ändamål. Fördelarna med elektroporering jämfört med virala leveransmetoder är dock: 1) multipel plasmidleverans till enskilda celler, 2) ingen begränsning av skärstorleken15 och 3) enkel kontroll av området och tidpunkten för leverans. Dessutom kan inriktningsspecificiteten förbättras genom att använda härstamningsspecifika promotorer. Detta är ibland svårt i virala system på grund av gränsen för virusförpackningar.
Liksom elektroporeringens natur är elektroporerade epitelceller slumpmässigt isär med friska, oredigerade celler (figur 4G). Denna mosaik i genetiskt modifierade och omodifierade celler kan dock vara fördelaktig för att studera cancerinitiering, eftersom den rekapitulerar den sporadiska karaktären av tidig cancerinitiering inom en immunkompetent mikromiljö. Frekvensen av elektroporerade celler kan justeras genom att variera DNA / RNA / RNP-lösningskoncentrationerna och / eller elektroporeringsparametrarna. Med hjälp av CRISPR-Cas-medierad genredigering i kombination med det presenterade protokollet är det enkelt att screena flera gener och generera heterogena mönster av mutationer / allelkombinationer i riktade gener; Detta är särskilt användbart vid modellering av cancer som uppvisar ett stort antal genomiska förändringar som HGSC20,21. Genom att sekvensera riktade gener under cancerprogression är det dessutom möjligt att följa den klonala utvecklingen in vivo av tumörer och metastaser hos immunkompetenta möss12.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Katie Teng och Dr. Matthew J. Ford för att tillhandahålla plasmider som används för att generera representativa resultat och protokolloptimering. K.H. stöddes av doktorandstipendiet Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande &; Marcel Gosselin och Alexander McFee doktorander.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
| 1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
| 1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
| 3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
| 30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
| Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
| Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
| Analgesic | - | - | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
| Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) - Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
| Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
| Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
| Eye lubricant | Alcon | - | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
| Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
| Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
| Heating pad/disc | - | - | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
| Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
| Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
| Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
| Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
| Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
| Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
| Shaver | - | - | Hair removal cream can also be used. |
| Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
| Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
| Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |
References
- Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events. Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).
- Li, S., Winuthayanon, W. Oviduct: roles in fertilization and early embryo development. The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).
- Briceag, I., et al. Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility. Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature Communications. 8 (1), 1093 (2017).
- Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers. Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).
- Soong, T. R., et al. Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas. The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis. Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Teng, K., et al. Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).
- Ford, M. J., Yamanaka, Y. Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation. Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).
- Maresch, R., et al. Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice. Nature Communications. 7, 10770 (2016).
- Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens. Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway. Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
